Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Abstract

Fonte: Assetta, B., et al., Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos. J. Vis. (2020).

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Protocol

1. Indução de neurônios humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

1. Preparação de lentivírus (~ 5 dias, protocolo detalhado conforme descrito anteriormente)
   1. Placa ~ 1 milhão de células HEK293T em cada frasco T75 para que elas sejam ~ 40% confluentes ao realizar a transfecção. Transfecte-os com plasmídeos que expressam Ngn2 induzível por tetraciclina e gene resistente à puromicina (PuroR; sob o mesmo controle do promotor TetO), rtTA e os três plasmídeos auxiliares pRSV-REV, pMDLg / pRRE e VSV-G (12 μg de DNA de vetor lentiviral e 6 μg de cada DNA de plasmídeo auxiliar). Preparar pelo menos três frascos por preparação de lentivírus. Use PEI para transfecção seguindo as instruções do fabricante. Troque a mídia após 16 h e descarte.
   2. Colha partículas virais liberadas coletando meios de cultura todos os dias e substitua por meios frescos por 3 dias. Agrupe os meios coletados contendo partículas virais para purificação. Filtre o vírus através de um filtro de 0,22 μm e centrifugue a 49.000 x g por 90 min. Ressuspenda o pellet no volume apropriado de PBS-glicose (~ 150 μL).
2. Indução de neurônios (~5 dias)
   nota: Este protocolo de indução (Figura 1A; fluxograma) é altamente eficaz para células iPS e ES de pluripotência validada (que pode ser testada por coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência bem caracterizados; Figura 1B).
   1. Use células ES humanas H1 disponíveis comercialmente na passagem de 52 (ver Tabela de Materiais). Cultive as células em placas de 6 poços revestidas com solução de matriz extracelular (~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços; consulte a Tabela de Materiais) usando meio de manutenção de células ES (consulte a Tabela de Materiais) e incube as placas a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. No Dia -2, desconecte as células ES (80% confluentes) com 1 mL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 10 min. Transfira as células para um tubo; lave o poço com 2 mL de meio e misture no mesmo tubo. Centrifugue a 300 x g por 5 min, ressuspenda o pellet no meio e coloque as células em placas de 6 poços revestidas com matriz na densidade de semeadura de 1 x 10₅ células por poço.
   3. No Dia -1, adicione lentivírus expressando Ngn2 mais PuroR e rtTA junto com polibreno (8 μg / ml) às células ES em meio de manutenção de células ES fresco (ver Tabela de Materiais). A quantidade exata de vírus deve ser determinada pelos títulos reais ou pela titulação. Normalmente, adicionamos 5 μL de cada vírus por poço em uma placa de 6 poços.
   4. No Dia 0, adicione doxiciclina (2 μg/mL para ativar a expressão de Ngn2) em meio DMEM-F12 com suplemento de N2 sem morfógenos.
   5. No dia 1, adicione puromicina em meio fresco de DMEM-F12 mais N2 e doxiciclina, até a concentração final de 1 μg / mL de meio. Selecione as células transduzidas em Puromicina por pelo menos 24 h. Maior concentração de Puromicina (até 5 μg / mL) e período de seleção mais longo (até 48 h) podem ser necessários para remover adequadamente as células subtransduzidas se o título do vírus for baixo.
   6. No Dia 2, retire os neurônios diferenciadores com solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais), recoloque-os em placas de 24 poços (entre 80.000 e 200.000 células/poço) revestidas com solução de matriz (ver Tabela de Materiais) e mantenha-os em meio NBA/B27 sem doxiciclina. A densidade de semeadura é crítica.
   7. Nesta fase, os neurônios destacados podem ser congelados em um meio de congelamento comercial especializado (ver Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Os neurônios puros podem ser plaqueados representando a morte celular típica de ~ 15% a 20% após o descongelamento, cultivados sozinhos ou co-cultivados com outros tipos de células cerebrais.
   8. Cultivar iNs puros nas placas revestidas com soluções baseadas em matriz extracelular, conforme instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). A morfologia piramidal característica deve ser aparente no Dia 4 (e no Dia 6; Figura 1C). A formação de sinapses pode ser detectada já nos dias 14 a 16 e é proeminente no dia 24 por coloração imuno-histoquímica com marcadores pré e pós-sinápticos padrão. (Figura 1D; marcado com o marcador pré-sináptico Sinapsina 1 e o marcador dendrítico Map2).

Results

Figura 1: Geração direta de neurônios induzidos por humanos (iNs) a partir de hPSCs. (A) Fluxograma de geração de iN. (B) Imagens representativas de campo claro e imunofluorescência da cultura inicial de células-tronco pluripotentes humanas (H1) para confirmar a pluripotência. Oct4 é mostrado em vermelho e Sox2 em verde. (C) Imagens representativa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Tecnologias STEMCELL	7920
Suplemento B27	ThermoFisher	17504044
Meio DMEM/F12	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Doxiciclina	MilliporeSigma	D3072
Células ES humanas H1	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5825
Suplemento N2	ThermoFisher	17502001
Meio neurobasal A	ThermoFisher	Rolamento 10888-022
Aminoácidos não essenciais	ThermoFisher	Rolamento 11140-050
Pei	VWR	Rolamento 71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	Rolamento 12251
Polibreno	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
Puromicina	ThermoFisher	A1113803
Mídia de congelamento de progenitor neural STEMdiff	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5838
Kit de indução neural STEMdiff SMADi	Tecnologias STEMCELL	Nº 8581
Tempo-iOlogo: OPCs derivados de iPSC humanos	Tempo BioScience	Referência102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	Rolamento 52047
VSV-G	Addgene	Rolamento 12259