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1. Diferenciação neuronal
NOTA: Execute as etapas 1.1 a 1.5 antes do meio-dia e as etapas 1.7 após o meio-dia. Uma visão geral dos procedimentos de diferenciação é apresentada na Figura 1A.
- Transferir 350 μl (3,5 x 106) de ESCs para uma cápsula de 10 cm de fixação baixa contendo 25 ml de meio de diferenciação. Colocar num agitador orbital regulado para 30 - 45 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO2. Este é o primeiro dia de diferenciação, denominado dia in vitro (DIV) -8.
nota: O uso de uma placa de fixação ultrabaixa aumenta o custo do método, mas produz rendimentos ligeiramente maiores do que as placas de Petri bacterianas, uma vez que os agregados podem ocasionalmente aderir às placas de Petri. Se forem preferidos diferentes tamanhos de pratos, os volumes médios e os números de células podem ser dimensionados de acordo.
- Após 48 horas (DIV -6), utilizar uma pipeta de 25 ml para transferir os agregados celulares diferenciadores para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar imediatamente 25 ml de meio de diferenciação à placa de Petri.
- Deixe os agregados assentarem por 2 a 5 min, produzindo um pellet visível com 1 a 2 mm de profundidade. Ignore células individuais ou pequenos agregados que permanecem em suspensão. Aspirar cuidadosamente o meio e transferir o sedimento celular de volta para a placa de Petri utilizando um P1000. Coloque no agitador rotativo em uma incubadora de cultura de tecidos.
- No DIV -4, repita a etapa 1.2. O pellet terá 2 a 4 mm de profundidade. Substituir 30 ml de meio de diferenciação suplementado com 6 μM de ácido all-trans-retinóico (RA) na placa de Petri. Retorne ao agitador rotativo na incubadora de cultura de tecidos por mais 48 horas.
- Em DIV -2, repita a etapa 1.3. O pellet terá 4 a 8 mm de profundidade neste ponto.
- No DIV -1, prepare as superfícies de revestimento como na Seção 2.
- No DIV 0, descongelar 5 ml de meio de tripsinização NPC pré-aliquotado e congelado a 37 °C durante 5 a 10 min e colocar numa capa de cultura de tecidos. Com uma pipeta de 25 ml, transferir os agregados diferenciadores para um tubo cónico de 50 ml. Deixar assentar os agregados e aspirar cuidadosamente o meio. Lavar o pellet duas vezes com 10 ml de PBS, permitindo que os agregados assentem entre as lavagens.
- Após a segunda lavagem com PBS, adicione 5 ml de meio de tripsinização NPC ao pellet e incube a 37 °C durante 5 min. Agite suavemente o tubo após 2,5 min.
- Adicione 5 ml de inibidor de tripsina de soja (STI) a 0,1% para inativar a tripsina e misture invertendo. Triturar suavemente 10 a 15 vezes com uma pipeta serológica de 10 ml até obter uma suspensão celular relativamente homogénea.
- Transferir lentamente a suspensão celular para um filtro de células de 40 μm ou 70 μm colocado na parte superior de um tubo cónico de 50 ml. Uma vez filtrada toda a suspensão, adicionar 1 ml de meio N2 para lavar as células restantes através do filtro e aplicar um pellet na suspensão de células dissociadas durante 6 min a 200 x g.
- Aspirar o meio sem perturbar o pellet. Lave as células duas vezes com 10 ml de meio N2, peletizando as células por 5 min a 200 x g e triturando entre as lavagens com um P1000. Antes da segunda lavagem, conte as células usando um hemocitômetro.
- Ressuspenda as células em meio N2 a 1 x 107 células por ml e coloque ESNs em placas com uma densidade celular de 150.000 - 200.000 células / cm2.
- Transferir os ESNs recém-plaqueados para uma incubadora de cultura de tecidos umidificados a 37 °C e 5% de CO2 e manter como na Seção 3.
2. Preparando superfícies de cultura para o revestimento de precursores neurais no DIV 0
- Prepare pratos tratados com cultura de tecidos pelo menos 1 dia antes do revestimento. Adicionar polietilenoimina (PEI; 25 μg/ml em H2O estéril) ou poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml em H2O estéril) suficiente para cobrir as placas de plástico tratadas com cultura de tecidos e incubar O/N a 37 °C.
- Na manhã do revestimento, lave a louça duas vezes com H2O bidestilado e uma vez com PBS. Após a lavagem final, adicione meio N2 suficiente para cobrir o prato (por exemplo, 1 ml por poço de um prato de 12 poços ou 4 ml por prato de 6 cm).
- Preparar lamínulas de vidro de 18 mm pelo menos um dia antes da fixação dos neurónios. Limpe as lamínulas por limpeza de plasma por 4 min.
- Transferir imediatamente as lamínulas limpas para um parafilme lavado com etanol no fundo de uma cápsula grande e estéril e adicionar 400 μl de solução de PEI ou PDL, preparada como no passo 2.1. Incubar O/N a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecidos.
- De manhã, lave as lamínulas três vezes com água e adicione 5 μg / ml de laminina em PBS por 1 a 3 horas a 37 ° C. Antes de dissociar os neurônios, aspire a laminina e transfira imediatamente a lamínula para um poço de uma placa de 12 poços contendo 1 ml de meio NPC, certificando-se de manter o lado tratado voltado para cima.
- Armazene pratos e lamínulas a 37 ° C até que os NPCs estejam prontos para o prato.
3. Manutenção de neurônios
- No DIV 1, aspirar o meio e substituí-lo pelo meio de cultura N2.
- Nos DIV 2 e 4, aspirar o meio e substituí-lo por meio de cultura B27.
- No DIV 8, aspire o meio e substitua por meio de cultura B27 contendo inibidores mitóticos para eliminar as células não neuronais contaminantes.
- Na DIV 12, substitua por meio de cultura B27.
- Não remova DIV 12+ ESNs de 5% CO2 até que esteja pronto para uso.
