Separação magnética de células de Schwann de nervos ciáticos de camundongos

Resumo

Fonte: Blusch, A., et al., Mielinização in vitro de axônios periféricos em uma cocultura de explantes de gânglios da raiz dorsal de ratos e células de Schwann. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra um método para isolar células de Schwann das fibras do nervo ciático de camundongos.

Protocolo

1. Cultura de células de Schwann

1. Revestimento para cultura de células Schwann
   1. Cubra as placas de cultura de células em condições estéreis. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (TC) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C.
   2. Remova o PLL, lave os pratos TC 2x com água destilada e incube com 2 mL de 1 μg/cm² laminina durante a noite a 4 °C. Lave os pratos TC 2x com aqua dest e deixe as placas secarem ao ar.
2. Preparação de meio para cultura de células de Schwann
   1. Prepare 50 mL de meio de células de Schwann adicionando 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS), 2 μM de forscolina, 10 nM de neuregulina e 50 μg / mL de gentamicina ao meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F-12 (glicose alta) em condições estéreis.
   2. Prepare 70 mL do meio L-15 de Leibovitz com 50 μg / mL de gentamicina em condições estéreis.
3. Digestão enzimática do nervo ciático
   NOTA: As próximas etapas são executadas em condições estéreis.
   1. Prepare a solução de digestão enzimática contendo 0,25% de dispase II, 0,05% de colagenase tipo I e 50 μg / mL de gentamicina em 10 mL de DMEM (glicose alta).
   2. Centrifugue o tubo a 188 x g por 5 min a 4 ° C, remova o sobrenadante com uma pipeta sorológica de 25 mL e transfira o pellet com o meio L-15 de Leibovitz restante para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm usando uma pipeta de 1.000 mL.
   3. Lave o tubo de 50 mL com 10 mL da solução de digestão enzimática e adicione-o ao prato que contém as fibras nervosas. Distribua o tecido no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta para maximizar a superfície acessível para digestão.
   4. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 18 h e interromper a digestão adicionando 10 mL de FCS a 40% em solução salina balanceada de Hanks, sem Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS).
4. Separação celular
   1. Transferir os nervos digeridos para um tubo de 50 ml utilizando uma pipeta serológica e centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de DMEM contendo 10% de FCS e 50 μg/ml de gentamicina. Ressuspenda o pellet 20 vezes posteriormente, usando uma ponteira de pipeta de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL e 200 μL.
   2. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 100 μm e centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 4 ml de DMEM contendo 10% de FCS e 50 μg/ml de gentamicina.
   3. Adicionar 2 ml da suspensão celular a cada uma das duas placas de TC de 60 mm revestidas com PLL e laminina e incubar a 37 °C e 5% de CO₂. Deixe as placas intocadas por 2 dias na incubadora para proteger as células do estresse mecânico e apoiar a aderência.
5. Diferenciação de células de Schwann
   1. Após 2 dias, remova o meio e enxágue cuidadosamente as placas 2x com DMEM (glicose alta), 10% FCS e 50 μg/mL de gentamicina. Em seguida, adicione 2 mL de meio celular de Schwann. Substitua o meio celular de Schwann a cada 2 dias e observe a aparência e a confluência das células usando um microscópio.
6. Tripsinização celular e separação magnética
   1. Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 80% (6-12 dias de cultura), lave cuidadosamente as placas 2x com 3 mL de DPBS e incube com 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% (pré-aquecido a 37 °C) por 3 min. Quando as células se desprendem do fundo da placa, inative a digestão pela adição de 2 mL de DMEM com 10% de FCS e 50 μg/mL de gentamicina.
      nota: Atenha-se a um tempo de tripsinização de estritamente 3 min e prossiga rapidamente depois.
   2. Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão magnético de separação celular contendo DPBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 nM. Combine 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte as células usando uma câmara de coloração.
   3. Centrifugar a suspensão celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C e ressuspender o sedimento celular em 90 μL de tampão magnético de separação de células por 1 x 10⁷ células. Adicione 10 μL de microesferas de Thy-1 por 1 x 10⁷ células. Ressuspender a solução algumas vezes e incubar durante 15 minutos na escuridão a 8 °C.
   4. Adicionar 2 ml do tampão magnético de separação de células à suspensão de células e centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μL de tampão magnético de separação de células.
   5. Umedeça a coluna de separação de células magnéticas com 1 mL do tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células magnéticas. Aplique as células na coluna de separação magnética de células. Coletar o fluxo e centrifugar a 300 x g a 4 °C por 10 min.
      nota: Os fibroblastos são selecionados positivamente e permanecem na coluna, enquanto as células de Schwann passam pela coluna. Os fibroblastos podem ser coletados com um carimbo (por exemplo, como um controle negativo para protocolos de coloração de células de Schwann).
   6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml do meio de cocultura. Conte as células após a coloração com azul de tripano e uma câmara de coloração.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	8076.4
Filtro de células, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha	Rolamento 352360
Centrífuga 5810-R	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	5811000015
Incubadora de CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha	51017865
Dissipação II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	4942078001
Água destilada (Sistema de Purificação de Água)	Millipore, Molsheim, França	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	31331093
DPBS (sem íons de cálcio e sem íons de magnésio)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	F7524	O FCS deve ser testado para cultura de células de Schwann
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	5710064
HBSS (sem íons de cálcio e sem íons de magnésio)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	14170138
Laminina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	L2020-1MG
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha	130042303
Microtesoura	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha	15000-08
microscópio	Motic, Wetzlar, Alemanha	Motic BA 400
Lâmina de microscópio	VWR, Radnor, Estados Unidos da América	630-1985
Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha	130091632
Colunas MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha	130-042-201
Câmara de contagem de Neubauer	Assistente, Erlangen, Alemanha	Rolamento 40441
Pipetas	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	2231300004
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	Pág. 4707-50ML
Pipeta sorológica, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha	861254025
Pipeta sorológica, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha	861685001
Pipeta sorológica, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha	861253001
Prato TC 60, célula +	Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha	833901300
Microesferas Thy-1 (Kit MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha	130-094-523
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	Rolamento 25300-054
Colagenase tipo I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha	C1639
Banho-maria tipo 1008	GFL, Burgwedel, Alemanha	Nº 4285