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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de solução de fatia com alto teor de sacarose e líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
- Antes do dia experimental
- Prepare 1 L de pré-solução de 10x fatias com água tipo 1 de grau laboratorial contendo (em mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabela 1). Para evitar a precipitação de fosfato de cálcio, misture lentamente os produtos químicos em um béquer pré-cheio com 800 mL H2O, mexendo sempre com um agitador magnético. Conservar a solução a 4 °C ou à temperatura ambiente (RT).
- No dia experimental
- Prepare 1 L de 1x ACSF com água de grau laboratorial Tipo 1 contendo (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glicose (Tabela 2). Use um osmômetro de pressão de vapor para validar a osmolaridade entre 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
nota: Para evitar a precipitação de fosfato de cálcio, misture lentamente todos os produtos químicos sólidos em um béquer pré-cheio com 800 mL de H2O, mexendo sempre com um agitador magnético. Adicione MgSO4 e CaCl2 no final, pingando lentamente a quantidade necessária de soluções estoque 1 M.
- Borbulhar continuamente 1x solução ACSF em RT com carbogênio para definir o pH entre 7,3–7,4.
nota: Se o pH for um pouco alto ou muito baixo, pequenos ajustes na força de carbogenação seriam suficientes. Se o pH for superior a 7,45 com carbogenação, ajuste-o adicionando algumas gotas de solução 1 M NaH2PO4.
- Prepare 250 mL (por cérebro) de 1x solução de fatia com alto teor de sacarose em um béquer contendo 25 mL de pré-solução de 10x fatia e (em mM): 252 Sacarose, 26 NaHCO3 e 10 Glicose (Tabela 3). Verifique se a osmolaridade está entre 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
- Borbulhe a solução de fatia com alto teor de sacarose por 10 a 15 min com carbogênio para controlar o pH entre 7,3 a 7,4,
nota: Se o pH for superior a 7,45 com carbogenação, ajuste-o adicionando algumas gotas de solução 1 M KH2PO4.
- Conservar a solução de fatias com alto teor de sacarose durante 20 a 30 minutos no congelador (-80 °C) até ficar parcialmente congelada.
2. Dissecção e posicionamento do cérebro murino
- Transfira o cérebro para a placa de cultura gelada de 35 mm e remova todo o cabelo ou partículas de sangue do tecido lavando suavemente o cérebro com uma pipeta Pasteur cheia de ACSF (o sangue tem efeitos citotóxicos no tecido cerebral).
- Transferir o cérebro com a ajuda da espátula sobre o papel de filtro embebido em cima da placa de cultura de 90 mm gelada (Figura 1A).
- Use uma lâmina para cortar o cérebro ao meio, separando os dois hemisférios, e coloque os dois hemisférios no lado medial recém-cortado.
- Use uma lâmina para remover a parte dorsal (5% a 10%) do cérebro de cada hemisfério com um corte paralelo ao topo dorsal (Figura 1C) e coloque os dois hemisférios no lado recém-cortado com a parte ventral do cérebro voltada para cima.
- Posicione uma gota de super cola na placa de amostra e espalhe adequadamente com uma ponta de pipeta para acomodar ambos os hemisférios.
- Use uma tira de papel de filtro para pegar um hemisfério com forças capilares tocando o lado ventral com a tira de papel de filtro, não danificando assim o tecido.
- Use outra tira de papel de filtro para secar cuidadosamente o lado dorsal do cérebro antes de posicionar o hemisfério, com o lado dorsal voltado para baixo, em cima da cola na placa da amostra. Repita o mesmo procedimento com o segundo hemisfério.
nota: Os hemisférios devem ser posicionados em alinhamento horizontal de forma espelhada na placa vibratomá, com os lados rostrais apontando para fora e os lados caudais voltados para (mas não se tocando) no meio. Os lados mediais de ambos os hemisférios devem apontar para a lâmina do vibratomo e os lados laterais para o experimentador (Figura 1D).
- Coloque a placa de amostra na câmara de fatiamento e rapidamente, mas com cuidado, cubra-a com lama de solução de fatia com alto teor de sacarose gelada. Assim que a solução tocar a cola, ela solidificará e colará adequadamente os hemisférios à placa da amostra.
- Certifique-se de que os hemisférios estejam devidamente cobertos com uma solução de fatia com alto teor de sacarose e confirme se a solução está borbulhada com carbogen.
nota: Todo o procedimento de dissecção deve ser realizado o mais rápido possível. Certifique-se de que o cérebro não fique sem o suprimento de oxigênio por muito tempo. Deve levar apenas cerca de 1 a 1,5 minutos desde a decapitação até a submersão cerebral na lama da solução de fatia com alto teor de sacarose. Este é o requisito mais crítico para preparações agudas de fatias de cérebro, a fim de garantir a alta qualidade da fatia.
3. Fatiamento horizontal do cérebro
- Posicione a lâmina do vibratomo na frente do lado medial dos hemisférios e abaixe-a até a mesma altura dos lados ventrais dos hemisférios que agora estão voltados para cima. Abaixe a lâmina com a ajuda do controle do vibratomo para 600 μm mais na direção dorsal e comece a fatiar. A lâmina deve atingir o tecido (caso contrário, inverta a lâmina e abaixe-a um pouco mais). Corte até que as duas primeiras fatias estejam completamente separadas dos dois hemisférios.
- Inverter a lâmina e baixar mais 300 μm e cortar novamente.
- Quando o hipocampo se tornar visível (use o atlas do cérebro do camundongo para obter ajuda, se necessário) (Figura 1E), colete as fatias com a pipeta de plástico Pasteur alargada. Colete as fatias até que o putâmen caudado se torne visível próximo ao hipocampo. Normalmente, entre 8 e 12 fatias de 300 μm (4 a 6 por hemisfério) podem ser coletadas para o cérebro do camundongo.
- Use a pipeta de plástico Pasteur para coletar as fatias e transferi-las para a câmara de recuperação no banho-maria (Figura 1F) (colete as fatias após cada rodada de fatiamento para evitar que flutuem na câmara de fatiamento).
nota: Trabalhe o mais rápido possível e certifique-se de que a solução de fatia com alto teor de sacarose esteja gelada e carbogenada durante todo o procedimento. Se necessário, reabasteça o gelo ao redor da câmara de fatia.
4. Recuperação de fatias de cérebro para registros eletrofisiológicos
- Deixar as fatias na câmara de recuperação cheia de FCSA no banho-maria a 32 °C durante 1 h.
NOTA: As câmaras de recuperação também estão disponíveis comercialmente.
- Retire a câmara de recuperação do banho-maria.
- Coloque as fatias em RT por pelo menos mais 30 minutos para recuperação antes de iniciar qualquer outra aplicação.
Receitas de buffer e mídia.
Tabela 1: 10 x pré-solução de fatias (1 L).
| composto | Concentração (mM) | Peso molecular (g/mol) | Montante (g) |
| Kcl | 25 | 74,55 | 1.86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | 2,46 |
| KH2PO4 | 12.5 | 136.08 | 1.7 |
Tabela 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaridade entre 305–315 mOsm).
| composto | Concentração (mM) | Peso molecular (g/mol) | Montante (g) |
| NaCl | 125 | 58.44 | 7.3 |
| Kcl | 2.5 | 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | algarismo | de 1 M Solução de CaCl2 | 2 mL |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | a partir de 1 M de solução de MgSO4 | 1 mL |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156.02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| Glicose * H2O | 25 | 198,17 | 4.95 |
Tabela 3: 1x solução de fatia com alto teor de sacarose (250 mL) (osmolaridade entre 320–325 mOsm).
| composto | Concentração (mM) | Peso molecular (g/mol) | Montante (g) |
| 10x presolução de fatia | N/A | N/A | 25 mL |
| sacarose | 252 | 342,3 | 21.57 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 0,55 |
| Glicose * H2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
