Geração de fatias de amígdala inclinadas a partir de um cérebro de camundongo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Bosch, D., et al. Ex Vivo Dissecção Optogenética de Circuitos de Medo em Fatias de Cérebro. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra a geração de fatias de amígdala inclinadas a partir de um cérebro de camundongo. O cérebro é posicionado em um ângulo no estágio de espécime de vibratomo para obter fatias contendo a amígdala e os axônios do córtex pré-frontal medial que formam conexões sinápticas com a amígdala. As fatias do cérebro são mantidas na temperatura fisiológica para preservar o tecido para experimentos futuros.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação de cortes agudos

Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (FCA), solução cortante, ferramentas (tesoura, bisturi, fórceps, espátula, pipeta de Pasteur) e blocos de ágar.
Nota: 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) é necessário por experimento e é preparado dissolvendo produtos químicos em H₂O duplamente destilado, conforme publicado anteriormente. A solução de corte é preparada suplementando 200 ml de ACSF com 0,87 ml de solução-mãe de MgSO₄ 2 M.
Oxigenar ACSF e solução de corte durante todo o experimento com 95% de O₂ e 5% de CO_2.
Anestesiar profundamente o camundongo usando uma máquina de anestesia para pequenos animais usando isoflurano (3% em oxigênio). Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de retirada do membro antes de continuar.
Decapite o mouse usando uma tesoura grande e resfrie imediatamente a cabeça em uma solução de corte gelada.
Abra o crânio por uma única incisão na linha média de caudal para rostral e empurre suavemente pedaços de crânio para os lados usando uma pinça. Remova rapidamente o cérebro levantando-o suavemente para fora do crânio usando uma espátula pequena e arredondada. Corte o cerebelo com bisturi. Coloque o cérebro em uma solução de corte gelada.
Para córtex pré-frontal medial ou locais de injeção de mPFC: corte a parte anterior do cérebro (contendo mPFC) usando um bisturi e coloque em solução de corte gelada até cortar.
Remova o excesso de solução de corte com papel de filtro e cole a parte posterior do cérebro no vibratomo stage.
Para fatias de amígdala inclinadas, cole o cérebro em um bloco de ágar (4%) cortado em um ângulo de 35° (Figura 1D, meio). Para fatias de amígdala coronal, locais de injeção de núcleo geniculado medial / núcleo talâmico intralaminar posterior (MGm / PIN) e locais de injeção de mPFC, cole o cérebro diretamente no palco (Figura 1D, esquerda e direita). Coloque um bloco de ágar adicional atrás do cérebro para estabilidade durante o corte.
Coloque o stage na câmara de corte com solução de corte oxigenada gelada que é mantida a 4 °C usando uma unidade de resfriamento. Prepare fatias agudas da amígdala (320 μm) usando uma lâmina de safira. Coloque as fatias em uma câmara de interface alimentada com ACSF oxigenado à temperatura ambiente (RT).
Após a preparação das fatias agudas da amígdala, coloque a câmara de interface em banho-maria a 36 °C para recuperar as fatias por 35 a 45 min. Em seguida, retorne a câmara de interface para RT.
Durante o início do passo 1.10, corte as fatias dos locais de injeção conforme descrito anteriormente para as fatias agudas da amígdala (passos 1.8 - 1.9). A recuperação das fatias no banho-maria não é necessária aqui. opcional: Para estimar rapidamente a localização do local da injeção, observe as fatias em um estereoscópio equipado com uma lâmpada fluorescente e conjuntos de filtros apropriados.

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Resultados

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Figura 1. Injeções estereotáxicas, preparação de fatias cerebrais agudas e visualização de fibras pré-sinápticas.(A, B) Injeção de vírus estereotáxica. A) Imagem do camundongo anestesiado colocado em um quadro estereotáxico com o crânio exposto e a pipeta de injeção. Inserção: Amplie a imagem da pipeta de injeção cheia de solução de vírus misturada com verde rápido. Barra de escala: ...