Gerando uma fatia de cérebro coronal expondo as regiões da amígdala de um cérebro de camundongo

Abstract

Fonte: Bosch, D., et al. Ex Vivo Dissecção Optogenética de Circuitos de Medo em Fatias de Cérebro. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a preparação de finas fatias de cérebro coronal de um cérebro murino, expondo as regiões da amígdala ricas em conexões sinápticas do córtex pré-frontal medial. As fatias são então recuperadas em líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado para manter a viabilidade neuronal.

Protocol

1. Preparação de cortes agudos

1. Preparar ACSF, solução cortante, ferramentas (tesoura, bisturi, fórceps, espátula, pipeta Pasteur) e blocos de ágar.
   NOTA: 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) é necessário por experimento. Conforme publicado anteriormente, o ACSF é preparado dissolvendo produtos químicos em H2O duplamente destilado. A solução de corte é preparada suplementando 200 ml de ACSF com 0,87 ml de solução-mãe de MgSO₄ 2 M.
2. Oxigenar ACSF e solução de corte durante todo o experimento com 95% de O₂ e 5% de CO₂.
3. Anestesiar profundamente o camundongo usando uma máquina de anestesia para pequenos animais, usando isoflurano (oxigênio a 3%). Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de retirada do membro antes de continuar.
4. Decapite o rato usando uma tesoura grande e resfrie imediatamente a cabeça em uma solução de corte gelada.
5. Abra o crânio por uma única incisão na linha média de caudal a rostral e empurre suavemente pedaços do crânio para os lados usando uma pinça. Remova rapidamente o cérebro levantando-o suavemente para fora do crânio usando uma pequena espátula arredondada. Corte o cerebelo com bisturi. Coloque o cérebro em uma solução de corte gelada.
6. Para locais de injeção de mPFC, use um bisturi para cortar a parte anterior do cérebro (contendo mPFC) e coloque-o em uma solução de corte gelada até fatiar.
7. Remova o excesso de solução de corte com papel de filtro e cole a parte posterior do cérebro no vibratomo stage.
8. Para fatias de amígdala coronal, locais de injeção de MGm / PIN e locais de injeção de mPFC, cole o cérebro diretamente no palco (Figura 1D, esquerda e direita). Coloque um bloco de ágar adicional atrás do cérebro para estabilidade durante o corte.
9. Colocar a platina numa câmara de corte com uma solução de corte oxigenada gelada mantida a 4 °C utilizando uma unidade de arrefecimento. Usando uma lâmina de safira, prepare fatias coronais da amígdala. Colocar as fatias numa câmara de interface alimentada com ACSF oxigenado em RT.

Results

Figura 1. Injeções estereotáxicas, preparação de fatias cerebrais agudas e visualização de fibras pré-sinápticas. (A, B) Injeção de vírus estereotáxica. A) Imagem de um camundongo anestesiado colocado em uma estrutura estereotáxica com o crânio exposto e a pipeta de injeção. Inserção: Amplie a imagem da pipeta de injeção cheia de solução de vírus misturada com verde rápido. Barra de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)	Para composição, consulte as referências # 16 e # 23
Soluções de patch interno	Para composição, consulte as referências # 16 e # 23
Fatiador, Microm HM650V	Fisher Scientific, Alemanha	Rolamento 920120
Unidade de resfriamento para fatiador de tecidos, CU65	Fisher Scientific, Alemanha	Rolamento 770180
Lâmina de safira	Facas de diamante Delaware
Estereoscópio, SZX2-RFA16	Olympus, Japão