Uma técnica para isolar núcleos de células não neuronais no giro dentado do hipocampo

Resumo

Fonte: Kerloch, T., et al. Classificação negativa de neurônios de núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra um método para isolar núcleos intactos de células gliais e estaminais no giro dentado do hipocampo de camundongos (DG). O tecido DG é mecanicamente dissociado em um tampão de homogeneização a frio para liberar os núcleos. Detritos teciduais e outras organelas liberadas são descartados, e os núcleos são corados com uma coloração de DNA e um anticorpo conjugado com fluoróforo específico para o antígeno nuclear neuronal (NeuN). A classificação de núcleos ativados por fluorescência é então empregada para isolar os núcleos negativos para NeuN de células não neuronais.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto

1. Dissecção do DG (Tempo: 15 min)

1. Prepare os meios de isolamento de núcleos 1 e 2 (NIM1 e NIM2), tampão de homogeneização (HB) e meio de lavagem (WM) (Tabela 1). Coloque todos os tampões, meios, reagentes e ferramentas no gelo até que sejam necessários. Coloque o homogeneizador Dounce (consulte a Tabela de Materiais) no gelo durante a preparação (mínimo 1 h antes da etapa de homogeneização).
   nota: O NIM1 pode ser preparado e armazenado a 4 °C por até 6 meses. NIM2, HB e WM devem ser preparados na hora.
   cuidado: Manipule o ditiotreitol (DTT), o inibidor de protease e o Triton X-100 com cuidado. Esses compostos são irritantes para a pele e os olhos, extremamente tóxicos e perigosos para o ambiente aquático. Ao usar esses produtos químicos, use luvas de proteção, roupas, proteção para os olhos e rosto, lave bem as mãos após o manuseio e evite a liberação para o meio ambiente.
2. Eutanasiar um camundongo C57Bl/6J macho de 22 meses de idade por luxação cervical seguindo o procedimento do Home Office Schedule 1.
   nota: Veja a discussão para obter a justificativa sobre o uso de camundongos de 22 meses neste estudo. No entanto, este protocolo pode ser realizado em qualquer idade ao longo da vida.
3. Disseque o cérebro de um camundongo sacrificado e transfira-o para uma placa de Petri de 10 cm cheia de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada (Figura 1). Coloque a placa de Petri no gelo. Remova o cerebelo usando um bisturi e corte o cérebro ao meio entre os dois hemisférios (ao longo do eixo sagital).
4. Encha uma nova placa de Petri de 10 cm com PBS gelado e coloque-a no gelo. Transfira metade do cérebro para a nova placa de Petri. Usando binóculos, disseque o GD e repita esta etapa para obter o segundo DG da segunda metade do cérebro.
   nota: Essas etapas (etapas 1.2-1.4) foram adaptadas de um procedimento descrito anteriormente. É importante proceder o mais rápido possível nesta fase para preservar a integridade das células.
5. Transfira os dois DGs para o homogeneizador Dounce pré-resfriado e adicione 1 mL de HB frio.

2. Dissociação tecidual, isolamento de núcleos únicos e imunomarcação anti-NeuN (Timing: 2 h)

1. Homogeneizar o tecido com 10 pinceladas do pilão "A" solto, seguidas de 15 pinceladas do pilão "B" apertado.
   nota: A homogeneização Dounce deve ser realizada com a argamassa no gelo com movimentos suaves para reduzir o calor causado pelo atrito e pela formação de espuma. Todos os tampões e equipamentos devem ser pré-resfriados e mantidos no gelo durante o procedimento.
2. Transferir o homogeneizado para um tubo pré-arrefecido de 15 ml; lavar o homogeneizador Dounce com 1 ml de HB frio e combinar no mesmo tubo. Adicione 3 mL de HB ao tubo de 15 mL e incube 5 min no gelo. Misture 2x invertendo o tubo suavemente.
3. Umedeça previamente uma tampa de filtro de 70 μm com 0,5 mL de HB sobre um tubo de ensaio de 50 mL. Coe a suspensão de núcleos da etapa 2.2 inclinando suavemente o tubo de 15 mL para dentro do filtro de células. Lave o filtro de células com 0,5 mL de HB.
4. Remova o filtro de células e centrifugue o tubo de ensaio a 500 x g por 5 min a 4 ° C, usando uma centrífuga de balde oscilante. Descarte o sobrenadante.
   nota: Forçar o homogeneizado ajudará a reduzir os detritos, o que é crítico para a citometria de fluxo e as etapas a jusante do sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq).
5. Ressuspenda o pellet suavemente em 4 mL de HB usando uma pipeta P1000. Incubar no gelo por 5 min. Centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de WM.
6. Umedeça previamente uma tampa de filtro de 35 μm sobre um tubo de ensaio de 15 mL com 0,5 mL de WM. Coe a suspensão dos núcleos da etapa 2.5 através do filtro de células, pipetando suavemente 0,5 mL de cada vez usando uma pipeta P1000.
7. Lave a tampa do filtro com 0,5 mL de WM e coloque o tubo no gelo. Transferir o filtrado para um novo tubo de 15 ml e centrifugar durante 5 min e 4 °C a 500 x g. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de WM.
8. Gire a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de WM com o antígeno nuclear antineuronal de camundongo (NeuN), anticorpo conjugado com AlexaFluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1: 32.000) e 1 μg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Incubar por 45 min no gelo no escuro.
   nota: Para otimizar a imunocoloração de núcleos isolados, recomenda-se titular o anticorpo para determinar a diluição ideal para análise e classificação por citometria de fluxo. Em seguida, execute controles adequados para confirmar se as condições de coloração são ideais. Por exemplo, com o anticorpo conjugado anti-NeuN-AF488, um controle negativo (ou seja, sem adição do anticorpo, Figura 2A) e um controle positivo (ou seja, coloração com o anticorpo, Figura 2B) foram executados para avaliar a segregação de populações não coradas e coradas. Ao começar a trabalhar com um anticorpo conjugado com AF488, recomenda-se a execução de um controle de isotipo conjugado com AF488 para avaliar a especificidade. Se um anticorpo não conjugado for usado, pode ser necessário um controle adicional, como adicionar um anticorpo secundário apenas a uma preparação de núcleos, para avaliar a ligação inespecífica do anticorpo secundário.

3. Classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS) para excluir populações neuronais (Timing: 45 min)

1. Transferir a suspensão de núcleos imunocorados para um tubo de ensaio de 5 mL e mantê-lo no gelo até o início do procedimento de citometria de fluxo.
   nota: Se estiver trabalhando com pedaços maiores de tecido do que dois DG de camundongos, pode ser necessária uma diluição adicional com tampão WM para evitar o entupimento do classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) se a densidade de núcleos na solução se tornar alta.
2. Vortex as amostras por 3 s em baixa velocidade antes de colocar os tubos no instrumento FACS (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: (Configuração FACS) As máquinas de classificação precisam ser alinhadas no início do procedimento com as partículas de calibração seguindo as recomendações do fabricante. O atraso de queda foi calibrado com contas ou microesferas (ver Tabela de Materiais) de acordo com o modelo FACS. As amostras foram classificadas a 4 °C no modo de pureza. Para reduzir o volume de coleta, os núcleos foram separados através de um bico de 70 μm na pressão recomendada para o citômetro de fluxo. Os núcleos foram classificados em tubos de baixa ligação de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais) contendo 50 μL de WM. Todos os tubos de coleta foram revestidos com PBS + 5% de albumina de soro bovino (BSA) a 4 °C durante a noite para reduzir o risco de aderência dos núcleos às paredes do tubo.
3. Para adquirir os dados de uma amostra da suspensão de núcleos corados, defina as portas na altura DAPI e na área DAPI para excluir os detritos celulares e os núcleos agregados (Figura 3A). Além disso, separe os núcleos individuais de quaisquer agregados corados com DAPI restantes ou detritos celulares, definindo as portas na área de dispersão do lado logarítmico (SSC) e na área de dispersão direta logarítmica (FSC) (Figura 3B).
4. Defina as portas para o anti-NeuN-AF488 e a área FSC, para isolar a população negativa para NeuN-AF488, conforme mostrado na Figura 3C.
5. Após a análise, usando a estratégia de gating descrita acima, classifique a população negativa para NeuN-AF488 em um tubo de coleta de 1,5 mL preenchido com 50 μL de WM.
   nota: Seguindo a estratégia de gating descrita acima e o procedimento de dissecação para isolar o DG do cérebro de um camundongo adulto, espera-se que a população negativa para NeuN-AF488 represente ~ 14% dos núcleos individuais.

Tabela 1: Composições de mídia e tampões utilizados no estudo.

Meio de isolamento de núcleos #1 (NIM1) – armazenar até 6 meses a 4 °C
componente	Volume (μL)	Concentração final (mM)
1,5 M de sacarose	1.833,30	250
1 M KCl	275	25
1 M MgCl2	55	5
Tampão Tris de 1 M, pH 8,0	110	10
Água livre de nuclease	8.726,70	-
Volume total	11.000	-
Meio de isolamento de núcleos #2 (NIM2) – tornar fresco
componente	Volume (μL)	Concentração final
NIM1	10.769	-
1 mM TDT	11	1 μM
100x Inibidor de protease	110	1x
Triton X-100 10% (v/v)	110	0,1% (v/v)
Volume total	11.000	-
Tampão de homogeneização (HB) – tornar fresco
componente	Volume (μL)	Concentração final
NIM2	10.958,75	-
Inibidor de RNase, 40 U μL-1	27,5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
Volume total	11.000	-
Lavar Mídia (WM)
componente	Volume (μL)	Concentração final
BSA 7,5%	1.466,70	1% de sucesso
Inibidor de RNase, 40 U μL-1	27,5	100 U mL-1
RNasina, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
Pbs	9.492,05	-
Volume total	11.000	-

Resultados

Figura 1: Preparação de uma suspensão de núcleo único do DG dissecado de camundongos adultos para snRNA-seq de populações não neuronais. Fluxograma descrevendo as principais etapas do protocolo que incluem dissecção de DG de camundongo, preparação de uma suspensão de núcleos únicos, imunocoloração NeuN e classificação negativa de NeuN-FANS antes de prosseguir com snRNA-seq.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
microtubo de 0,5 ml	Eppendorf	30124537
Microesferas de carboxilato de 10,00μm Flouresbrite YG	Policiências	15700-10
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL	Corning	430052
2 pares de pinças Dumont #5 estéreis	Ferramentas de Belas Ciências	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
Sistema 4150 TapeStation	Agilent	N/A
Tubo de ensaio de polipropileno de alta clareza de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão	falcão	352063
Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão do filtro de célula	falcão	352235
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL	Corning	430829
Filtro de células de 70 μm	falcão	Rolamento 352350
8 partículas de calibração SPHERO Rainbow de pico	BD Biociências	RCP-30-5A
Grânulos Accudrop	BD Biociências	N/A
Centrífuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/A
Anticorpo anti-NeuN, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugado	Millipore	MAB377X
Citômetro de fluxo de fusão BD FACSAria	BD Biociências	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
BSA 7,5%	Gibco	15260037
Ditiotreitol (TDT)	Thermo Científico	R0861
Conjunto de moedor de lenços Dounce: almofariz, pilão solto (A) e pilão apertado (B)	Kimble	D8938-1SET
Eppendorf Tubes Proteína LoBind 1,5ml	Eppendorf	30108116
Halt, 100x Inibidor de protease	ThermoFisher	Rolamento 78429
Kcl	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
LUNA-FX7 Contador de células automatizado	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
N°10 bisturis descartáveis estéreis protegidos	Swann-Morton	Nº 6601
Água livre de nuclease	Sigma Aldrich	W4502-1L
Par de tesouras cirúrgicas estéreis para estudantes	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91401-12
Pbs	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
Inibidor de RNase 40 U μl-1	Ambion	AM2684
RNasina 40 U μl-1	Promega	N211A
Placa de Petri estéril	Corning	430167
sacarose	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampão Tris, pH 8,0	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Azul de tripano	Invitrogen	T10282