Uma técnica para isolar núcleos de células não neuronais no giro dentado do hipocampo

Resumo

Fonte: Kerloch, T., et al. Classificação negativa de neurônios de núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra um método para isolar núcleos intactos de células gliais e estaminais no giro dentado do hipocampo de camundongos (DG). O tecido DG é mecanicamente dissociado em um tampão de homogeneização a frio para liberar os núcleos. Detritos teciduais e outras organelas liberadas são descartados, e os núcleos são corados com uma coloração de DNA e um anticorpo conjugado com fluoróforo específico para o antígeno nuclear neuronal (NeuN). A classificação de núcleos ativados por fluorescência é então empregada para isolar os núcleos negativos para NeuN de células não neuronais.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto

1. Dissecção do DG (Tempo: 15 min)

1. Prepare os meios de isolamento de núcleos 1 e 2 (NIM1 e NIM2), tampão de homogeneização (HB) e meio de lavagem (WM) (Tabela 1). Coloque todos os tampões, meios, reagentes e ferramentas no gelo até que sejam necessários. Coloque o homogeneizador Dounce (consulte a Tabela de Materiais) no gelo durante a preparação (mínimo 1 h antes da etapa de homogeneização).
   nota: O NIM1 pode ser preparado e armazenado ....

Resultados

Figura 1: Preparação de uma suspensão de núcleo único do DG dissecado de camundongos adultos para snRNA-seq de populações não neuronais. Fluxograma descrevendo as principais etapas do protocolo que incluem dissecção de DG de camundongo, preparação de uma suspensão de núcleos únicos, imunocoloração NeuN e classificação negativa de NeuN-FANS antes de prosseguir com snRNA-seq.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
microtubo de 0,5 ml	Eppendorf	30124537
Microesferas de carboxilato de 10,00μm Flouresbrite YG	Policiências	15700-10
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL	Corning	430052
2 pares de pinças Dumont #5 estéreis	Ferramentas de Belas Ciências	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
Sistema 4150 TapeStation	Agilent	N/A
Tubo de ensaio de polipropileno de alta clareza de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão	falcão	352063
Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão do filtro de célula	falcão	352235
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL	Corning	430829
Filtro de células de 70 μm	falcão	Rolamento 352350
8 partículas de calibração SPHERO Rainbow de pico	BD Biociências	RCP-30-5A
Grânulos Accudrop	BD Biociências	N/A
Centrífuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/A
Anticorpo anti-NeuN, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugado	Millipore	MAB377X
Citômetro de fluxo de fusão BD FACSAria	BD Biociências	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
BSA 7,5%	Gibco	15260037
Ditiotreitol (TDT)	Thermo Científico	R0861
Conjunto de moedor de lenços Dounce: almofariz, pilão solto (A) e pilão apertado (B)	Kimble	D8938-1SET
Eppendorf Tubes Proteína LoBind 1,5ml	Eppendorf	30108116
Halt, 100x Inibidor de protease	ThermoFisher	Rolamento 78429
Kcl	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
LUNA-FX7 Contador de células automatizado	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
N°10 bisturis descartáveis estéreis protegidos	Swann-Morton	Nº 6601
Água livre de nuclease	Sigma Aldrich	W4502-1L
Par de tesouras cirúrgicas estéreis para estudantes	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91401-12
Pbs	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
Inibidor de RNase 40 U μl-1	Ambion	AM2684
RNasina 40 U μl-1	Promega	N211A
Placa de Petri estéril	Corning	430167
sacarose	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampão Tris, pH 8,0	Qualquer fornecedor de produtos químicos		Feito em laboratório
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Azul de tripano	Invitrogen	T10282