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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Materiais
- Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo:
- Prepare o tampão de carga adicionando soro fetal bovino (FBS, 2%) à solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicione corante vermelho neutro (NR) (1% final) ao PBS.
- Prepare as seguintes soluções usando o Kit de Dissociação Cerebral Adulto disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- Para preparar a mistura enzimática 1, pipete 1,9 mL de tampão Z e 50 μL de enzima P em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Para preparar a mistura enzimática 2, pipete 20 μL de tampão Y e 10 μL de enzima A em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Prepare a solução de remoção de detritos.
2. Perfusão e dissecção de camundongos
- Por via intraperitoneal (i.p.), injete no camundongo 500 μL de corante NR a 1% em PBS 2-3 h antes da anestesia.
nota: A injeção intraperitoneal de NR em modelos de camundongos desmielinizantes ajuda a discernir as lesões (Figura 1).
- Anestesiar o camundongo com pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e garantir que o camundongo seja anestesiado com sucesso, examinando as respostas à dor.
- Abra a cavidade torácica do mouse e exponha o coração.
- Corte cuidadosamente um pequeno canto do átrio direito e perfunda intracardialmente o camundongo com 20-30 mL de PBS frio do ventrículo esquerdo.
- Decapite o camundongo sob anestesia.
- Abra o crânio do rato e liberte cuidadosamente o cérebro do crânio.
- Transfira o cérebro para o molde de fatia de cérebro de camundongo e corte o cérebro em fatias de 0,1 cm.
- Retire as fatias de cérebro e coloque-as em PBS frio em uma placa de Petri (60/15 mm). Usando pinças microcirúrgicas, microdissecar as lesões marcadas com corante NR ao redor do corpo caloso sob um estereomicroscópio.
nota: Certifique-se de que o tecido dissecado esteja o mais completo possível para facilitar a transferência subsequente; O progresso total da dissecção deve ser concluído em 2 h.
- Transferir o tecido dissecado para tubos de centrífuga de 15 mL contendo a quantidade adequada de tampão de carga a frio.
nota: Agrupe o tecido do corpo caloso de 2-3 camundongos em um tubo como uma amostra.
3. Dissociação tecidual
- Centrifugar o tecido dissecado a 300 ×g durante 30 s (depois de atingir esta velocidade) para recolher a amostra no fundo do tubo.
- Pré-aqueça a mistura enzimática 1 e 2 a 37 °C em uma incubadora.
- Adicione 1.950 μL de mistura enzimática pré-aquecida 1 a uma amostra e digerir em uma incubadora a 37 ° C por 5 min.
- Adicione 30 μL de enzima pré-aquecida misture 2 e misture delicadamente.
- Digerir numa incubadora a 37 °C durante 15 min e misturar suavemente de 5 em 5 min.
- Adicione 4 mL de PBS frio ao tubo após a digestão e agite suavemente.
- Coloque filtros de 70 μm em tubos de centrífuga de 50 mL e pré-umedeça os filtros com 500 μL de PBS frio. Filtre o tecido dissociado passando as amostras de tecido digerido pelos filtros e transfira a suspensão filtrada no tubo de centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga de 15 mL.
nota: Pule esta etapa se a quantidade de tecido for muito pequena.
- Centrifugar as amostras de tecido filtrado a 300 ×g durante 10 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante lenta e completamente.
nota: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo, exceto a digestão enzimática.
4. Remoção de detritos
- Ressuspenda o pellet celular suavemente com 1.550 μL de PBS frio.
- Adicione 450 μL de solução fria para remoção de detritos e misture bem.
- Cubra a mistura acima lenta e suavemente com 2 x 1 mL de PBS frio usando uma pipeta de 1.000 μL.
nota: Incline o tubo da centrífuga em 45 ° e adicione lentamente PBS ao longo da parede do tubo com a pipeta.
- Transferir o tubo lenta e suavemente para uma centrífuga e centrifugar a 4 °C e 3.000 × g durante 10 min.
- Procure três camadas após a centrifugação. Aspire as duas camadas superiores completamente usando uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
- Encha o tubo até 5 mL com tampão de carregamento a frio e inverta suavemente o tubo três vezes.
- Centrifugar a 4 °C e 1.000 × g durante 10 min. Aspirar completamente o sobrenadante e evitar que o sedimento da célula se desfaça.
5. Separação magnética de células microgliais
- Ressuspenda o pellet celular com 90 μL de tampão de carga e adicione 10 μL de grânulos CD11b (Microglia).
- Misture bem e incube por 15 min a 4 °C.
- Adicione 1 mL de tampão de carregamento e pipete suavemente o líquido para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL para lavar as células após a incubação. Centrifugar as células a 4 °C e 300 × g durante 10 min e aspirar completamente o sobrenadante para remover as esferas não ligadas.
- Ressuspenda as células em 500 μL de tampão de carga.
- Colocar a coluna MS com o seu separador para uma selecção positiva no campo magnético.
- Enxágue a coluna com 500 μL de tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética, seguindo o protocolo do fabricante.
- Aplique a suspensão de células na coluna MS e descarte o fluxo contendo células não marcadas.
- Adicione 500 μL de tampão de carga à coluna três vezes para lavar as células que aderem à parede da coluna e descartar o fluxo.
nota: Adicione um novo buffer de carregamento para lavagem apenas quando o reservatório da coluna estiver vazio.
- Remova a coluna do separador após lavá-la e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Adicione 1 mL de tampão de carregamento na coluna e empurre o êmbolo para o fundo para lavar as células marcadas magneticamente. Repita esta etapa três vezes para coletar completamente as células marcadas magneticamente.
