Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação da solução
- Placas de ágar NGM (1 L)
- Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de meio peptonada (por exemplo, Bacto-Peptone) e 20 g de ágar. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5 mg / mL em estoque de etanol a 95% [EtOH]), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4 e 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg / mL).
- Placas de RNAi de ágar NGM (1 L)
- Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de meio peptona e 20 g de ágar. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5 mg / mL em estoque de EtOH a 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg / mL), 1 mL de 1 M isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e 1 mL de carbenicilina (50 mg / mL).
- Luria-Bertani (LB)-Ágar (1 L)
- Adicione 10 g de meio peptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 20 g de ágar, 10 mL de 1 M Tris pH 8,0. Adicione H2O a 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina 50 mg / mL e 2,5 mL de tetraciclina 5 mg / mL.
- LB Médio (1 L)
- Adicione 10 g de meio peptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 10 mL de 1 M Tris pH 8,0. Adicione H2O a 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de 50 mg / mL de carbenicilina.
- Tampão M9 (1 L)
- Adicione 6,0 g de Na2HPO4, 3 g de K2PO4, 5 g de NaCl e 50 mg de gelatina. Antes de usar, adicione 1 mL de 1 M MgSO4.
- Solução clareadora (10 mL)
- Adicione 1 mL de NaClO e 2 mL de NaOH 5 N. Adicionar H2O a 10 ml.
2. Preparação de placas de RNAi
Nota: C. elegans é tipicamente cultivado em laboratório em placas de Petri de 6 cm contendo 7,5 mL de ágar meio de crescimento de nematóides (NGM-Agar). Este protocolo é otimizado para vermes mantidos a 15 °C. Para preparar placas com NGM, use técnicas estéreis padrão para evitar contaminação fúngica e bacteriana. A seguir está o protocolo para preparar placas NGM suplementadas com reagentes para RNAi.
- Preparar placas de ARNi NGM-Agar de 6 cm contendo 1 mM de IPTG e 50 μg/ml de carbenicilina. Deixe-os secar por 24 a 48 h em temperatura ambiente no escuro.
- Mantenha as placas de RNAi a 4 ° C no escuro. Não use se tiver mais de 14 dias.
- Selecione o clone de bactéria RNAi (Escherichia coli HT115) contendo o plasmídeo L4440 com a sequência de DNA do gene lin-53 do estoque de glicerol congelado da biblioteca de RNAi disponível13 em placas de ágar LB contendo 50 μg/mL de carbenicilina e 12,5 μg/mL de tetraciclina usando o padrão de estrias trifásicas. Cultive a bactéria a 37 °C durante a noite. Este clone permite a produção dependente de IPTG de lin-53 dsRNA na bactéria.
- Além disso, cultive bactérias de RNAi que contenham o plasmídeo L4440 sem nenhuma sequência gênica como controle de vetor vazio.
- No dia seguinte, pegue uma única colônia de lin-53 ou placas de ágar LB vetor vazias usando uma ponta de pipeta de 200 μL e inocule cada uma delas em um tubo de cultura separado contendo 2 mL de meio LB líquido suplementado com 50 μg / mL de carbenicilina. Cultive culturas durante a noite a 37 °C até atingirem uma densidade óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Meça a DO usando um espectrofotômetro.
CUIDADO: O meio LB líquido não deve conter tetraciclina em contraste com a placa LB-ágar usada para retirar as bactérias do estoque de glicerol, uma vez que a inclusão de tetraciclina durante a alimentação leva a uma diminuição da eficiência do RNAi.
- Adicionar 500 μL de cada cultura bacteriana (lin-53 ou vetor vazio) a placas de RNAi NGM-Agar de 6 cm utilizando uma multipipeta. Incube as placas com a tampa fechada durante a noite em temperatura ambiente no escuro para secar. Durante esse tempo, o IPTG nas placas NGM induzirá a produção de dsRNA na bactéria.
- Use pelo menos 3 placas por cultura bacteriana por experimento. Isso fornecerá 3 réplicas técnicas para cada experimento.
- Conservar placas de ágar-RNAi NGM secas com bactérias a 4 °C no escuro durante um período máximo de duas semanas.
3. Preparação de C. elegans Cepa BAT28
- Manter a cepa de verme BAT288 contendo os transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] em bactérias OP50 usando placas NGM-Agar padrão a 15 °C.
Nota: Para obter um protocolo detalhado sobre a cultura de nematóides, consulte. O rol-6 (su1006) é um alelo dominante e marcador de injeção fenotípica comumente usado16 que causa o movimento típico de rolamento. É usado no transgene otIs305 para rastrear hsp-16.2prom::che-1.
- Manter a estirpe BAT28 a 15 °C em permanência para evitar a activação preventiva do transgene hsp-16.2prom::che-1. Reduza a exposição a temperaturas superiores a 15 °C enquanto manuseia a cepa o máximo possível.
- Para sincronizar os vermes com a idade, use a técnica de branqueamento.
- Lave as placas de ágar-NGM de 6 cm contendo adultos e ovos de BAT28 usando tampão M9 de 900 μL. Vermes de pellets centrifugando a 900 x g por 1 min. Remova o sobrenadante.
- Adicione 0,5 a 1 mL de solução clareadora e agite o tubo por aproximadamente 1 min até que os vermes adultos comecem a se abrir. Monitor usando um estereomicroscópio padrão.
- Vermes da pelota centrifugando em 900 x g por 1 min. Remova o sobrenadante.
- Lave o pellet de minhoca 3 vezes adicionando 800 μL de tampão M9 e centrifugando a 900 x g.
- Coloque os ovos limpos em placas frescas de NGM semeadas com bactérias OP50. Cultive uma população branqueada de bactérias OP50 a 15 °C até atingirem o estágio L4 (aproximadamente 4 dias). As larvas L4 podem ser reconhecidas por uma mancha branca aproximadamente na metade do lado ventral do verme18 usando um estereomicroscópio padrão.
nota: Para atingir o fenótipo de conversão de células germinativas em neurônios após a depleção de lin-53, ele precisa ser esgotado na geração parental (P0). A pontuação para o fenótipo de conversão é realizada na geração seguinte (geração filial F1). Para atingir o esgotamento da lin-53 já no P0, os animais L4 são submetidos ao RNAi.
- Transfira manualmente 50 vermes de estágio L4 por réplica usando um fio de platina para uma placa NGM que não contenha nenhuma bactéria e deixe os vermes se afastarem de qualquer bactéria OP50 transferida. Deixe as minhocas se moverem no prato por cerca de 5 minutos. Use bactérias das placas de RNAi NGM-Agar previamente semeadas com bactérias de RNAi lin-53 (ou controle de vetor vazio) para transferir para as respectivas placas de RNAi.
- Evite transferir bactérias OP50 para as placas de RNAi reais. Trabalhe rápido para minimizar o tempo de exposição da cepa a temperaturas superiores a 15 °C.
- Incubar vermes em placas de RNAi NGM-Agar a 15 ° C por aproximadamente 7 dias até que a progênie F1 dos vermes atinja o estágio L3 - L4. Eles podem ser claramente separados dos animais P0, pois são maiores e mais grossos que a progênie F1.
- Verifique visualmente sob um estereomicroscópio padrão se os vermes da progênie F1 mostram o fenótipo da vulva saliente (pvul), conforme mostrado na Figura 1. O RNAi contra o lin-53 tem efeitos pleiotrópicos e causa o fenótipo pvul, que pode ser usado para avaliar se o RNAi contra o lin-53 foi bem-sucedido.
nota: O RNAi contra lin-53 também pode causar letalidade de embriões F1. Este efeito aumenta se as placas forem expostas a graus superiores a 15 °C antes de os animais atingirem o estádio L3 – L4. Embriões mortos podem ser reconhecidos pelo desenvolvimento interrompido e pela falta de eclosão.
- Incube as placas no escuro, pois o IPTG é sensível à luz.
4. Indução da Reprogramação de Células Germinativas
- Incubar placas de RNAi examinadas contendo lin-53 e progênie F1 tratada com RNAi de vetor vazio por 30 min a 37 ° C no escuro para ativar o CHE-1. Use uma incubadora ventilada, pois permite um choque térmico mais eficiente.
- Permitir que os animais em choque térmico recuperem durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, incubar as placas a 25 °C durante a noite no escuro.
- Usando um estereomicroscópio padrão acoplado a uma fonte de luz de fluorescência, examine os animais sob o filtro de proteína fluorescente verde (GFP) para sinais derivados de gcy-5prom::gfp na área do meio do corpo dos vermes, conforme mostrado na Figura 2. Definir microscópio para sinais GFP: excitação máxima em 488 nm com emissão máxima em 509 nm.
- Avalie o grau de conversão de células germinativas em neurônios montando animais com sinais de GFP na área do meio do corpo em lâminas de microscopia contendo almofada de ágar.
- Conte o número de animais que mostram a conversão de células germinativas em neurônios versus os animais escuros para avaliar a penetrância do fenótipo. Normalmente, cerca de 30% dos animais mostram sinais discretos de GFP na linha germinativa após a depleção da linha-53, enquanto não mais de 5% dos animais mostram sinais difusos de GFP na linha germinativa após o RNAi do vetor vazio.
