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Isenção de responsabilidade: Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Homogeneização mecânica do cérebro e da medula espinhal
NOTA: Os volumes descritos nesta seção são suficientes para a homogeneização de metade do cérebro ou da medula espinhal.
- Pré-resfrie a argamassa de vidro do moedor de lenços Dounce (Tabela de Materiais) colocada no gelo.
- Adicione 3 mL de solução salina balanceada 1x Hank's pré-resfriada (HBSS) à argamassa.
- Transfira o tecido (cérebro ou medula espinhal) do poço da placa de 6 poços para a argamassa de vidro, certificando-se de que ela seja mergulhada em 1x HBSS e fique no fundo da argamassa.
- Esmague suavemente o tecido com 10 pinceladas de pilão A seguidas de 10 pinceladas de pilão B. Transfira a mistura homogeneizada para um novo tubo cônico de 15 mL.
- Encha o tubo até um volume final de 10 mL usando 1x HBSS pré-resfriado e centrifugue por 10 min a 320 x g a 4 ° C.
- Aspire o sobrenadante e adicione 1x HBSS gelado a cada tubo até um volume final de 7 mL e ressuspenda suavemente o pellet por vórtice.
2. Remoção de detritos
NOTA: A remoção de detritos, compostos principalmente de tecido não digerido e bainhas de mielina, é uma etapa crítica para permitir a coloração eficiente do homogeneizado tecidual para análises de citometria de fluxo subsequentes.
- Filtre cada amostra através de um filtro de células de 70 μm para remover quaisquer pedaços de tecido não digeridos. Esta etapa é particularmente importante ao trabalhar com tecidos da medula espinhal, pois essas amostras são mais propensas a conter fragmentos de nervos ou meninges não digeridos que podem afetar as etapas subsequentes.
- Certifique-se de que o volume final seja de 7 mL em cada tubo de amostra. Caso contrário, encha com 1x HBSS gelado até 7 mL.
- Adicione 3 mL de solução isotônica de Percoll (IPS) pré-resfriada a cada amostra para fazer um volume final de 10 mL de uma solução contendo meio gradiente de densidade a uma concentração final de 30%. Agite suavemente as amostras para garantir que sejam misturadas de forma homogênea.
- Centrifugue amostras por 15 min a 700 x g a 18 °C, certificando-se de definir a aceleração da centrífuga para 7 e o freio para 0,
nota: A centrifugação deve levar aproximadamente 30 min.
- Remova delicadamente as amostras da centrífuga.
nota: Um disco esbranquiçado composto de detritos e mielina deve ser visível flutuando na superfície da solução. Um pellet (contendo as células de interesse) deve ser visível no fundo do tubo.
- Aspire cuidadosamente todo o disco esbranquiçado de detritos e depois o resto do sobrenadante, tomando cuidado para não desalojar o pellet. Deixe cerca de 100 μL de solução em cima do pellet celular para evitar o risco de desalojá-lo inadvertidamente.
- Adicione 1 mL de solução de bloqueio (BL) de citometria de fluxo (FACS), ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 1000 μL e transfira as amostras para tubos de 1,5 mL.
- Centrifugue por 5 min a 450 x g em temperatura ambiente (RT).
- Aspirar suavemente o sobrenadante e ressuspender o sedimento no tampão adequado compatível com as análises a jusante