Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação dos materiais
- Tampão de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS): Prepare 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) (Tabela de Materiais) em PBS-/-.
- Solução-mãe de colagenase IV (20 U/μL): Ressuspender o pó em PBS+/+ (Tabela de Materiais), alíquota e armazenar a -20 °C.
nota: A colagenase IV requer que o MgCl2 esteja totalmente ativo; não congele e descongele a solução de colagenase IV.
- Solução anestésico-analgésica: Misturar 150 μL de cetamina (150 mg/kg), 25 μl de xilazina (5 mg/kg) e 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) em 1 mL de PBS-/-.
nota: Prepare a solução anestésico-analgésica de improviso e não a mantenha por mais de um dia.
- Solução de heparina (100 U/mL): Ressuspenda o pó em PBS-/-.
- Preparar o sistema de inserção de perfusão que liga um tubo a um decantador Erlenmeyer cheio de PBS-/-. Ligue uma agulha de 23 G à extremidade do tubo de perfusão. Abra a inserção de infusão e deixe o PBS funcionar até que não haja bolhas no tubo.
- Prepare a lupa binocular equipada com uma luz.
2. Alojamento de camundongos C57BL/6
- Para a análise de células mieloides ou T (plexos coróides), use quatro camundongos para cada um e agrupe os quatro CP (dois de cada ventrículo lateral, o terceiro ventrículo e o quarto ventrículo CP; para oito camundongos no total). Não agrupar a PC acarreta o risco de não detectar as raras populações imunes na PC devido à sua baixa abundância.
- Deixe os ratos se aclimatarem por pelo menos 7 dias antes de qualquer experimentação. Mantenha os camundongos em condições livres de patógenos em temperatura e umidade constantes, em um ciclo claro/escuro de 12/12 h ou 14/10 h, com água e ração padrão ad libitum.
3. Perfusão PBS e dissecção cerebral
- Pese cada camundongo e injete 10 μL / g da solução de mistura anestésico-analgésica (etapa 1.3) por via intraperitoneal.
- Aguarde cerca de 30 minutos para uma analgesia eficiente (verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos do mouse).
- Posicione o mouse anestesiado de costas no suporte de dissecção e prenda as palmas das mãos no suporte de dissecação.
- Beliscando a pele do animal com uma pinça e usando uma tesoura, abra o abdômen, o diafragma e o tórax para expor o coração.
nota: Quando o tórax é aberto, o cérebro torna-se anóxico. Deve-se proceder com precisão e rapidez nas próximas etapas da perfusão.
- Injete 20 μL de solução de heparina 100 U/mL diretamente no ventrículo esquerdo.
- Com uma tesoura fina, faça uma incisão de pelo menos 3 mm no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora do corpo.
- Imediatamente depois, insira a agulha 23 G colocada na extremidade do tubo de infusão através da ponta do ventrículo esquerdo.
- Abra o sistema de infusão no máximo e aguarde a perfusão completa: Usando uma agulha 23 G a uma taxa de fluxo de cerca de 6 mL/min, a perfusão é completa em 3 min.
nota: A descoloração uniforme de órgãos como o fígado atesta a eficácia da perfusão.
- Feche o sistema de infusão e remova a agulha do ventrículo cardíaco.
- Remova a fita das palmas das mãos do mouse. Coloque o mouse em uma posição ventral.
- Beliscando a pele do animal com uma pinça e usando uma tesoura, remova a pele do topo da cabeça, dos olhos às orelhas.
- Com a ajuda de uma tesoura, corte o crânio primeiro entre os olhos e depois lateralmente de cada olho até a medula espinhal, logo acima dos músculos masseteres. Para isso, use a extremidade da tesoura e proceda com cuidado para evitar danificar o cérebro com a tesoura.
- Abra o crânio com uma pinça, apertando-o da extremidade entre os olhos.
- Use uma tesoura para cortar a medula espinhal e extrair o cérebro com uma pinça, colocando seus dois pontos na lateral do cérebro para incliná-lo e colocá-lo em uma placa de Petri cheia de PBS +/+ gelado. Os CPs são então recolhidos imediatamente.
nota: Verifique se há descoloração do cérebro para verificar a eficácia da perfusão.
4. Dissecção do plexo coróide do cérebro
- Posicione o lado dorsal do cérebro para cima na placa de Petri e abaixo das objetivas das lupas binoculares.
- Com a ajuda de uma pinça para manter o cérebro no lugar, insira as duas extremidades de outra pinça na linha média entre os hemisférios.
- Use a pinça para puxar o córtex com o caloso e o hipocampo para longe do septo, expondo o ventrículo lateral e uma parte do terceiro ventrículo.
- Identifique o CP lateral como um longo véu que reveste o ventrículo lateral que está queimando em ambas as extremidades. Use as duas extremidades de uma pinça fina para pegar o CP lateral. Tenha cuidado para coletar a parte posterior triangular que pode estar escondida pela dobra posterior do hipocampo.
- Afaste o córtex, o corpo caloso e o hipocampo do hemisfério contralateral do septo para expor todo o terceiro ventrículo e o ventrículo lateral oposto.
- Colete o terceiro CP com pinça fina, que pode ser identificada como uma estrutura curta com aspecto de superfície granular.
- Colete o outro CP lateral.
- Insira as duas extremidades de uma pinça entre o cerebelo e o mesencéfalo. Separe o cerebelo da ponte e da medula para expor o quarto ventrículo.
- Identifique o quarto PC como uma estrutura globular longa com um aspecto de superfície granular que reveste o quarto ventrículo da extremidade lateral direita para a extremidade esquerda entre o cerebelo e a medula. Colete o quarto CP com pinça fina.
nota: O revestimento à base de silano da pinça pode evitar a viscosidade da CP na pinça.
- Repita as etapas 3.1-4.9 para cada um dos outros sete mouses. Enquanto isso, o CP coletado pode ser mantido temporariamente em um tubo colocado no gelo.
5. Preparação de amostras para análise por citometria de fluxo
- Encher o tubo contendo todo o CP dissecado até 750 μL de PBS+/+.
nota: A deposição de CP dissecada com pinça fina no tubo produz um pequeno volume de PBS+/+. Para evitar uma possível perda do tecido CP, é melhor completar o volume existente para 750 μL do que removê-lo e substituí-lo por 750 μL de PBS+/+.
- Adicione 15 μL de solução estoque de colagenase IV a 20 U / μL (consulte a etapa 1.2) para uma concentração final de 400 U / mL.
nota: A DNAse I (150 μg/mL) pode prevenir a aglomeração excessiva de células.
- Incubar CP com colagenase IV a 37 ° C sob agitação leve (300 RPM) por 45 min.
- Pipete suavemente para cima e para baixo cerca de 10 vezes para finalizar a dissociação do CP.
- Encha o tubo CP até 1,5 mL com tampão MACS (consulte a etapa 1.1 da receita) para interromper a atividade IV da colagenase.
nota: A atividade da colagenase IV é interrompida em baixas temperaturas e inibida pela albumina sérica.
- Centrifugar as células a 500 x g, durante 5 min, a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e lavar as células com 1,5 ml de tampão MACS.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min, a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 220 μL de tampão MACS.
