Obtenção de uma cultura de células gliais mistas de um cérebro de camundongo neonatal

Resumo

Fonte: Sarkar, S. et al., Isolamento Magnético CD11b Rápido e Refinado da Microglia Primária com Maior Pureza e Versatilidade. J. Vis. Exp. (2017)

O vídeo demonstrou o método de isolar e cultivar células de um cérebro de camundongo neonatal. Envolveu dissociação enzimática e mecânica do cérebro, seguida de cultura em meios de crescimento sem fator de crescimento neuronal para obter uma população glial mista.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Cultivo de culturas gliais mistas

1. Decapite filhotes de 1 a 2 dias rapidamente com uma tesoura de operação de 5,5 polegadas e coloque as cabeças imediatamente em um tubo de 50 mL no gelo. Observe que essa decapitação é o modo de eutanásia.
2. Em uma capa de fluxo de ar laminar, faça uma pequena incisão no crânio e nas meninges usando uma tesoura de microdissecação reta de 4,5 polegadas. Comece a cortar da extremidade caudal para a extremidade rostral (nariz). Fique por baixo da pele usando a abertura formada pela decapitação.
   1. Após a incisão, descasque um dos hemisférios para o lado. Em seguida, use uma pinça curva ou em forma de gancho para remover todo o cérebro.
3. Mergulhe o(s) cérebro(s) em um novo tubo de 50 mL contendo ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% por 15 min em banho-maria a 37 °C. Use 2 mL de tripsina-EDTA por cérebro.
4. Lave o(s) cérebro(s) com meio de crescimento fresco (10% de soro fetal bovino (FBS), mistura F12 de meio de águia modificado de Dulbecco / nutriente (DMEM / F12), 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio e 1% de aminoácidos não essenciais) adicionando e removendo o meio. Repita isso 4x.
5. Para cada cérebro, coloque dois frascos T-75 contendo meios de crescimento. Portanto, adicione 2 mL de meio de crescimento por cérebro ao tubo. Assim, será equivalente a 1 mL de cérebro homogeneizado com 8-9 mL de meio de crescimento por frasco T-75.
6. Homogeneizar triturando o (s) cérebro (s) com pipetas de diferentes tamanhos de abertura, em ordem do maior para o menor. Quando for visível que o tecido cerebral não está diminuindo, faça a transição para a próxima pipeta. No final da trituração, a suspensão deve estar clara, sem pedaços visíveis.
   1. Use uma pipeta de 25 mL, uma pipeta de 5 mL e, em seguida, uma pipeta de 10 mL sequencialmente.
7. Passe cada suspensão cerebral homogênea por um filtro de células de 70 μm para transformá-la em uma única cultura de células.
8. Para cada cérebro homogeneizado, coloque dois frascos T-75 contendo meios de crescimento, conforme descrito na etapa 1.5 (1 mL de cérebro homogeneizado com 8-9 mL de meio de crescimento por frasco T-75).
9. Troque os meios de crescimento após 6 dias e cresça até o isolamento no^16º dia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Tecnologias da Vida	11330057
Piruvato de sódio	Tecnologias da Vida	11360070
Aminoácidos não essenciais MEM (100x)	Tecnologias da Vida	11140050
L-Glutamina (100x)	Tecnologias da Vida	25030081
Edta	Fisher Científico	AM9260G
Soro fetal bovino	sigma	13H469
0,25% de tripsina-EDTA	Gibco da Life Technologies	25200