Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células semelhantes à microglia

Resumo

Fonte: Funes, S. et al., Células semelhantes à microglia humana: diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas e ensaio de fagocitose de células vivas in vitro usando sinaptossomos humanos.J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o procedimento de diferenciação de células pluripotentes humanas em células semelhantes à microglia. O processo envolve a formação de corpos embrióides, transferindo-os para poços revestidos e usando fatores de crescimento específicos para guiar a diferenciação em precursores primitivos de macrófagos, que finalmente se diferenciam em células semelhantes à micróglia.

Protocolo

1. Diferenciação da microglia

NOTA: Uma visão geral do protocolo está resumida na Figura 1.

1. Cultura de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)
   nota: Mais detalhes descrevendo as técnicas de cultura iPSC podem ser encontrados em outro lugar.
   1. Descongelamento e manutenção
      1. Prepare o meio iPSC, alíquota e armazene-o a -20 °C por até 6 meses. Descongele as alíquotas durante a noite a 4 °C e use-as por até 1 semana. Deixe a mídia em temperatura ambiente por pelo menos 1 h antes de usar.
      2. Cubra os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de 10 μg / mL de laminina 521 diluída em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo cálcio e magnésio. Mantenha as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por pelo menos 2 h ou de preferência durante a noite. Uma vez diluída, conservar a laminina a 4 °C durante 3 meses.
      3. Prepare a solução-mãe do inibidor de Rho quinase Y27632 (inibidor de ROCK) 10 mM diluindo em água estéril. Faça alíquotas de uso único da solução inibidora de ROCK e armazene-as a -20 °C por até 1 ano.
      4. Prepare o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM diluindo a solução estoque de EDTA 0,5 M em DPBS.
      5. Para descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs congelados, coloque-o em banho-maria a 37 °C até que esteja quase descongelado. Transfira imediatamente o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo cónico de 15 ml contendo 4 ml de meio iPSC. Centrifugue a 500 × g por 1 min.
      6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando lentamente 1 mL de meio iPSC contendo 10 μM de inibidor de ROCK contra a parede do tubo para evitar perturbar as colônias.
      7. Adicione 1,5 mL de meio iPSC contendo 10 μM de inibidor de ROCK a cada um dos poços revestidos e transfira as colônias ressuspensas gota a gota para os poços contendo o meio.
         nota: Use 5-7 gotas da etapa 1.1.1.6 para manutenção da cultura, mas ajuste a densidade de semeadura ideal para cada linha iPSC.
      8. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para a frente. Colocar as células numa estufa a 37 °C e 5% de CO₂. No dia seguinte, substitua completamente o meio adicionando meio iPSC novo sem inibidor de ROCK.
      9. Para manutenção, trocar o meio todos os dias até que as células atinjam 80% de confluência.
         nota: As células podem ser mantidas sem alterar o meio por 2 dias se o meio iPSC usado permitir um horário de alimentação flexível. É aconselhável limitar isso a uma vez por passagem e somente se as células forem menos de 50% confluentes.
   2. Dividir
      1. Aspire o meio e lave as células com 1 mL de DPBS (sem cálcio e magnésio).
      2. Para desalojar as células, adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM e incube por 2-3 min em temperatura ambiente até que as bordas das colônias de células se levantem da superfície do poço. Lave as células novamente com DPBS e adicione 1 mL de meio iPSC.
      3. Dissocie as colônias de células raspando-as suavemente usando um elevador de células. Raspe cada área do poço apenas uma vez para evitar perturbar as colônias.
         nota: Métodos alternativos para desalojar as colônias do poço podem ser encontrados em outros lugares.
      4. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, colete as células e transfira-as gota a gota na proporção de 1:6 (células para meio) em poços pré-revestidos (conforme mencionado na etapa 1.1.1.2) contendo 1,5 mL de meio iPSC.

2. Diferenciação de iPSC para células semelhantes à microglia (iMGs)

NOTA: As pequenas moléculas e fatores de crescimento são dissolvidos em albumina de soro bovino a 0,1% filtrada estéril em DPBS a uma concentração estoque 1.000 vezes maior que a concentração final. Recomenda-se diferenciar iPSCs em iMGs durante as primeiras passagens. Recomenda-se o cariótipo de rotina das linhas iPSC.

1. Prepare a solução de revestimento padrão
   1. Descongelar a solução de reserva de um reagente de revestimento de matriz extracelular em gelo a 4 °C durante a noite.
   2. Pré-resfriamento de tubos de microcentrífuga e ponteiras de pipeta de filtro a 4 °C.
   3. Alíquota de 250 μL do reagente concentrado de revestimento de matriz extracelular em cada tubo e colocar imediatamente sobre gelo. Armazenar as alíquotas a -20 °C.
   4. Para preparar a solução de revestimento, descongelar uma das alíquotas do reagente de revestimento da matriz extracelular com gelo a 4 °C durante a noite.
   5. Adicione 50 mL de meio / nutriente Eagle modificado F12 (DMEM-F12) de Dulbecco gelado otimizado para o crescimento de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas (referido como DMEM-F12) a um tubo cônico pré-resfriado e mantenha-o no gelo.
   6. Resfrie uma ponta de pipeta de 1 mL pipetando DMEM-F12 gelado para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, use imediatamente a ponta da pipeta para transferir 250 μL do reagente de revestimento da matriz extracelular para o tubo cônico que contém o meio DMEM-F12.
      nota: A solução de revestimento padrão pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C.
2. Formação do corpo embrióide (EB)
   1. Prepare o meio EB que pode ser mantido a 4 °C por até 4 dias.
   2. Assim que as iPSCs atingirem 80% de confluência, dissocie as colônias lavando com 1 mL de DPBS e adicionando 1 mL de um reagente de dissociação por 2 min a 37 ° C. Desaloje as colônias usando um levantador de células raspando várias vezes para criar uma suspensão de célula única. Colete as células e transfira tudo para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de DPBS.
   3. Centrifugue as células a 500 × g por 1 min, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio EB. Pegue 10 μL de células e dilua 1:1 com azul de tripano. Conte as células com um hemacitômetro e, com base na contagem de células, dilua o estoque de células até uma diluição final de 10.000 células por 100 μL. Para células de remeamento, adicione 100 μL das células diluídas por poço em uma placa de 96 poços de baixa aderência, fundo redondo.
      nota: Geralmente, 48 poços da placa de 96 poços podem ser obtidos de cada poço confluente de 80% de iPSCs.
   4. Centrifugar a placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante 4 dias. Realize uma troca de meio meio no dia 2 usando uma pipeta multicanal e coletando suavemente 50 μL de meio antigo e, em seguida, adicionando de volta 50 μL de meio EB fresco.
      nota: No dia 4, as iPSCs formarão estruturas celulares esféricas denominadas EBs, conforme descrito na seção de resultados. O processo de diferenciação do EB pode ser estendido até 7 dias, se necessário.
3. Geração de precursores de macrófagos primitivos (PMPs)
   1. Prepare o meio de base PMP, filtro estéril e armazene-o a 4 ° C por até 1 mês.
   2. Cubra os poços de uma placa de 6 poços adicionando 1 mL de solução de revestimento Matrigel gelada e incube a 37 ° C e 5% de CO₂ por pelo menos 2 h ou de preferência durante a noite.
   3. No dia 4 da diferenciação do EB, transfira os EBs para os poços revestidos com Matrigel, coletando os EBs com pontas de pipeta de 1 mL (usando uma pipeta). Pipete para cima e para baixo uma ou duas vezes para desalojar os EBs do poço. Segure a placa de 6 poços em um ângulo inclinado para permitir que os EBs se assentem na borda do poço.
      nota: Nove ou dez EBs podem ser plaqueados por poço revestido.
   4. Depois que todos os EBs estiverem assentados, pipete suavemente e remova o meio antigo usando uma ponta de pipeta de 1 mL, mantendo os EBs na borda do poço. Adicione 3 mL de meio completo PMP recém-preparado a cada poço. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para a frente. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
   5. Não mexa na placa por 7 dias para permitir que os EBs se fixem no fundo do poço. Após esse tempo, execute uma alteração de meio médio usando o meio completo PMP.
      nota: Neste ponto, a maioria dos EBs deve ser anexada à placa. Quaisquer EBs flutuantes podem ser removidos.
   6. Após 5-7 dias, inspecione os EBs sob um microscópio de campo de luz com ampliação de 4x para garantir que eles estejam presos ao fundo dos poços. Alterar o suporte conforme descrito no ponto 1.2.3.5. No dia 21, realizar uma troca completa do meio com 3 mL de PMP completo do meio.
      nota: Progenitores mielóides flutuando no meio podem ser evidentes neste ponto. Essas células devem ser descartadas durante a troca do meio.
   7. No dia 28, procure células redondas referidas como PMPs no sobrenadante e colete o meio contendo os PMPs usando uma pipeta de 10 mL e pipetador automático. Tome cuidado para não perturbar os EBs. Transferir os PMPs e o meio para um tubo cónico de 15 ml e proceder como descrito no passo 1.2.4.
      nota: Normalmente, os PMPs da mesma linha iPSC podem ser coletados de cinco poços de uma placa de 6 poços e agrupados em um único tubo cônico de 15 mL.
   8. Adicione 3 mL de meio completo PMP fresco para manutenção adicional dos EBs. Como os PMPs emergem continuamente dos EBs por mais de 3 meses, colete-os a cada 4-7 dias (não permita que o meio mude de cor para um tom amarelo) conforme descrito nas etapas 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
      nota: Embora os PMPs possam ser coletados por vários meses, eles podem mudar seu fenótipo ao longo do tempo.
4. Diferenciação para iMGs
   1. Prepare o meio base iMG (Tabela de Materiais), filtro estéril e armazene-o a 4 ° C por até 3 semanas.
   2. Uma vez que os PMPs tenham sido coletados em um tubo cônico de 15 mL, centrifugue-os a 200 × g por 4 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda os PMPs usando 1-2 mL de meio basal de iMG. Conte as células usando um hemocitômetro tomando uma pequena alíquota e diluindo 1:1 com azul de tripano.
      NOTA: 0,5-1,5 × 10⁶ PMPs são normalmente obtidos todas as semanas, dependendo da linha iPSC e da idade da cultura EB.
   3. Centrifugue o resto das células novamente a 200 × g por 4 min. Dilua os PMPs até a concentração desejada, de modo que as células sejam semeadas a uma densidade de ~ 10⁵ / cm² em placas tratadas com cultura de células usando meio completo de iMG recém-preparado. Realize uma mudança de meio meio usando meio completo de iMG recém-preparado a cada 3-4 dias ao longo de 10-12 dias para permitir a diferenciação terminal.
      nota: Nesse ponto, as células devem adquirir morfologia semelhante à da micróglia. Para confirmar o compromisso dos PMPs com o destino da microglia, a análise de imunofluorescência é realizada para corroborar a expressão de marcadores enriquecidos com microglia, como o receptor purinérgico P2RY12 e a proteína transmembrana 119 (TMEM119).
   4. Para preservar a saúde e a viabilidade celular, realizar todos os experimentos entre os dias 10 e 12 da diferenciação do iMG.

Resultados

Figura 1: Esquema do protocolo para diferenciar iPSCs em células semelhantes à microglia.No dia 0, uma vez que as iPSCs atingem 80% de confluência, as colônias são dissociadas em células únicas e cultivadas em meio EB para induzir a formação de EB. No dia 4, os EBs são coletados e plaqueados em meio PMP para induzir a geração de PMP. Após 28 dias, os PMPs são coletados e diferenciados terminalment...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais de cultura celular
Placas de 6 poços	Greiner Bio-One	Nº 657160
100 mm x 20 mm Tratamento de cultura de tecidos	TRATAMENTO CELULAR	Rolamento 229620
Elevador de Células, Dupla Extremidade, Lâmina Plana & Lâmina Estreita, Estéril	TRATAMENTO CELULAR	229305
Placa de 96 poços de fundo redondo de baixa aderência	Corning	7007
Placa de Cultura de Células Multipoços Modificada de Superfície de Fundo Plano Primaria de 24 poços	Corning	353847,
Placa de Cultura Multipoços Modificada de Superfície de Fundo Plano Transparente de 6 Poços Primaria	Corning	353846
Microplaca de fundo plano transparente de 96 poços Primaria	Corning	353872
Reagentes de dissociação celular
Accutase	Corning	25058CI	Reagentes de dissociação usados para diferenciação de neurônios motores inferiores
Reagente TrypLE	Tecnologias da Vida	12-605-010	Reagentes de dissociação usados para diferenciação da microglia
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Reagentes de revestimento para cultura de células
Matriz de membrana Matrigel GFR	Corning™	Rolamento 354230	Referido como reagente de revestimento de matriz extracelular
CellAdhere Laminina-521	Tecnologia STEMCELL	Rolamento 77004	Referido como laminina 521
Poli-D-Lisina	sigma	Pág. 7405	Reconstituir a 0,1 mg/ml em tampão borato
Poli-L-Ornitina	sigma	Pág. 3655	Reconstituir a 1 mg/ml em tampão borato
Componentes da mídia iPSC
Kit mTeSR Plus	Tecnologia STEMCELL	100-0276	Para preparar a mídia iPSC misturou os componentes a 1x
Componentes da mídia EB
BMP-4	Fisher Científico	PHC9534	Concentração final 50 ng/mL
Mídia iPSC			Concentração final 1x
Inibidor de ROCK Y27632	Fisher Científico	BD 562822	Concentração final 10 μM
Ccah	PeproTech	300-07	Concentração final 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	Concentração final 50 ng/mL
Componentes da mídia base PMP
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentração final 1x
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentração final 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	Rolamento 12001-988	Concentração final 1x
Componentes da mídia completa PMP
55 mM 2-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Concentração final 55 μM
IL-3	PeproTech	Artigos 200-03	Concentração final 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentração final 100 ng/mL
Mídia base PMP			Concentração final 1x
Componentes da mídia base iMG
DMEM/F12 avançado	Gibco	12634010	Concentração final 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentração final 1x
Suplemento de N2, 100x	Gibco	17502-048	Concentração final 1x
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentração final 100 U/mL
Componentes da mídia completa iMG
55 mM 2-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Concentração final 55 μM
IL-34	PeproTech ou Biologend	200-34 ou 577904	Concentração final 100 ng/mL
Mídia base iMG			Concentração final 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentração final 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentração final 50 ng/mL
Componentes da mídia base de indução
DMEM/F12 com HEPES	Gibco	11330032	Concentração final 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentração final 1x
Suplemento de N2, 100x	Gibco	17502-048	Concentração final 1x
Aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x	Gibco	11140050	Concentração final 1x
Componentes de meios de indução completos
Composto E	Calbioquímica	Rolamento 565790	Concentração final de 0,2 μM e reconstituir o reagente de estoque para 2 mM em etanol 1:1 e DMSO
Doxiciclina	sigma	D9891	Concentração final de 2 μg/ml e reconstituir o reagente de reserva a 2 mg/ml em DPBS
Mídia de base de indução			Concentração final 1x
Inibidor de ROCK Y27632	Fisher Científico	BD 562822	Concentração final 10 μM
Outros reagentes de cultura celular
Azul de Tripano, Solução a 0,4%	AMRESCO INC	K940-100ML
Albumina de soro bovino (BSA)	sigma	Rolamento 22144-77-0
DPBS com cálcio e magnésio	Corning	21-030-CV
SPBD sem cálcio e magnésio	Corning	21-031-CV	Referido como DPBS
Nocaute DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referido como DMEM-F12 otimizado para o crescimento de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas
Proteína Natural de Laminina para Camundongos	Gibco	23017015	Referido como laminina