Isenção de responsabilidade: Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissociação da retina
NOTA: Todas as etapas a seguir (até a coleta de células) precisam ser realizadas em um gabinete de biossegurança (BSC) A2 ou B2.
- Preparar a mistura de dissociação Papaína/DNase I do seguinte modo.
- Para seis retinas, adicione 75 μL de DNase I no tubo contendo 750 μL de papaína e misture cuidadosamente (mistura de dissociação).
- Para a preparação individual da amostra necessária para este protocolo, divida o volume total de 825 μL em três alíquotas: 275 μL da mistura em um tubo de 1,5 mL por camundongo (duas retinas). Calcule as quantidades necessárias de DNase I e Papaína de acordo.
nota: Até seis retinas podem ser dissociadas em um tubo de mistura de papaína / DNase I. No entanto, a preparação de amostras individuais resulta em menos aglomerados e melhor crescimento celular do que as amostras combinadas.
- Transfira duas retinas para a mistura de dissociação Papaína / DNase I. Use uma pipeta de transferência com um diâmetro de ponta aumentado, pegue as retinas, espere até que as retinas se acomodem na parte inferior da ponta e, em seguida, libere as retinas sem excesso de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) no tubo contendo a mistura de papaína / DNase I.
- Colocar num nutador e incubá-lo durante 10 min numa incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO2).
- Dissocie as células pipetando cuidadosamente para cima e para baixo (cerca de 20 a 30 vezes) com uma pipeta de 1 mL. Depois que as células forem dissociadas (ou seja, resultando em uma solução homogênea sem pedaços), adicione 275 μL de inibidor de protease ovomucóide do Kit de Dissociação de Papaína para neutralizar a Papaína. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo. NOTA: Se seis retinas foram dissociadas em 825 μL de mistura de papaína / DNase I, são necessários 825 μL de ovomucóide.
- Centrifugar a mistura a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Adicionar fator de crescimento epidérmico (EGF, 1 μL por 1 ml do meio de crescimento, reconstituído a 200 μg/ml em PBS) ao volume calculado do meio de crescimento (1 ml por ratinho) pré-aquecido a 37 °C.
NOTA: Dependendo do desenho experimental, o marcador de proliferação 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), bem como 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) ou outros fatores necessários podem ser adicionados no início do período de cultura.
- Remova os tubos cuidadosamente da centrífuga. Não toque no pellet no fundo do tubo.
- Remova o sobrenadante com cuidado e completamente. Ressuspenda o pellet celular com 500 μL de meio de crescimento suplementado com EGF.
- Transfira a suspensão celular para um poço da placa de 12 poços rotulada (Figura 1C). Enxágue o tubo com mais 500 μL do meio de crescimento suplementado com EGF e adicione-o ao poço (volume total de 1 mL por poço).
- Repita as etapas 1.8 e 1.9 com todas as outras amostras.
- Balance a placa do poço três vezes com cuidado (para frente e para trás; esquerda e direita). Coloque a placa na incubadora (37 °C, CO2).
nota: Se forem usados camundongos transgênicos, realize a genotipagem para cada animal (Figura 1D). Identifique camundongos Cre recombinase positivos e negativos e rotule a placa de acordo. Para este protocolo, apenas células de camundongos repórter positivos para Cre recombinase foram usadas para as próximas etapas. As células de amostras negativas para Cre são congeladas e usadas para outras aplicações.
2. Fase de crescimento
NOTA: A fase de crescimento tem uma duração de cerca de 4-5 dias (Figura 2B). Para adicionar líquidos a poços contendo células, a pipeta precisa apontar para a parede do poço e o líquido precisa ser liberado lentamente para evitar o desprendimento da célula. Não pipete diretamente em cima das células.
- Um dia após a dissociação, remova o meio e adicione 1 mL de meio de crescimento fresco suplementado com EGF.
- No dia 3, remova o meio e adicione 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para remover os detritos celulares. Balance suavemente para frente e para trás da esquerda para a direita. Remova o HBSS, repita a etapa de lavagem e adicione 1 mL de meio de crescimento pré-aquecido suplementado com EGF.
- Monitore as células todos os dias e avalie seu status de crescimento até que as células atinjam 90%-100% de confluência. A Figura 3 mostra um exemplo de bom crescimento de MG ao longo do tempo. Verifique se há possível contaminação ou morte celular. Descarte as culturas contaminadas.
nota: Para monitorar e registrar o estado da célula, tire imagens em várias ampliações usando um microscópio de luz com uma câmera acoplada e objetivas de 4x, 10x ou 20x. Neste estudo, um microscópio de fluorescência é usado.
3. Preparação de lamínulas com poli-L-ornitina (Poli-O) e revestimento de Laminina
NOTA: Esta etapa só é necessária se a marcação imunofluorescente e a microscopia confocal de varredura a laser forem realizadas. Lamínulas de vidro redondas (12 mm de diâmetro) são necessárias para uma imagem adequada. O protocolo de revestimento também pode ser encontrado na folha de dados do meio neuronal (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque lamínulas estéreis cuidadosamente no centro de cada poço de uma placa de 24 poços usando uma pinça de #2AP Dumont estéril.
nota: Coloque lamínulas no centro do poço. Colocar lamínulas perto da parede de um poço causará problemas de tensão superficial nas etapas seguintes.
- Descongele uma alíquota de Poly-O de 2,5 mL em temperatura ambiente e coloque 100 μL no centro de cada lamínula.
- Incubar a placa do poço durante 30 min numa incubadora a 37 °C.
- Remova o Poly-O e lave o poço com a lamínula três vezes com ~ 1 mL de água estéril.
- Deixe a placa do poço secar durante a noite no BSC. Descongele 2,5 ml de Laminin a 4 °C durante a noite.
- Na manhã seguinte, adicione 100 μL de Laminina no centro de cada lamínula e incube por 4 h em uma incubadora a 37 °C.
- Remova o Laminin com cuidado e completamente.
- Mantenha a placa a 4 °C se a passagem não puder ser realizada imediatamente.
nota: As lamínulas revestidas em placas preparadas podem ser conservadas durante alguns dias a 4 °C.
4. Passagem celular para remover sobreviventes neuronais
NOTA: A passagem celular é necessária para remover as células neuronais, não para aumentar a população celular. A glia se divide apenas algumas vezes e não crescerá mais após a passagem. Não dilua as suspensões celulares. As células de um poço confluente de uma placa de 12 poços podem ser distribuídas em um poço de uma placa de 12 poços ou em dois poços de uma placa de 24 poços. Quando lamínulas revestidas são usadas, apenas cerca de um terço da lamínula é revestida. Portanto, seis lamínulas em uma placa de 24 poços, com células confluentes (~ 80% -90%) podem ser obtidas de um poço de células confluentes de uma placa de 12 poços. Outras proporções também podem ser escolhidas para aumentar ou diminuir a densidade celular. Para este protocolo, é utilizado um camundongo repórter Cre+ [um experimento, dois tratamentos: miR-25 ou controle-miR; réplicas técnicas n = 3 (três lamínulas por tratamento), réplica biológica n = 1]. O número de réplicas técnicas e biológicas pode ser definido de forma diferente dependendo do desenho experimental.
- Verifique se as células são 90%-100% confluentes (também na margem do poço; Figura 3E, F).
- Remova o meio e adicione 1 mL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar. Balance suavemente o prato (para frente e para trás, esquerda e direita). Remova o HBSS completamente.
- Adicionar 500 μL de uma solução contendo tripsina pré-aquecida (pré-aquecida a 37 °C em um banho de esferas de metal) para separar as células do poço. Balance suavemente (para frente e para trás, da esquerda para a direita) e incube por 2 min em uma incubadora a 37 °C.
- Mova a placa da incubadora para o BSC. Enquanto inclina, aspire a solução contendo tripsina e disperse-a cuidadosa e lentamente sobre o poço várias vezes até que as células se desprendam completamente. Segure a placa contra a luz e certifique-se de que não restam células na parte inferior.
- Transfira esta suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mL. Centrifugue a 300 x g durante 8 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente o pellet celular adicionando 600 μL (100 μL por poço para 6 poços/lamínulas) de meio de crescimento pré-aquecido (suplementado com EGF; 1:1000). e pipetando para cima e para baixo ~30-40 vezes.
nota: As células podem ser congeladas neste momento a -80 °C ou em nitrogênio líquido e descongeladas seguindo protocolos padrão para descongelamento de linhagens celulares. Se as células forem congeladas, elas não serão ressuspensas em um meio suplementado com EGF (meio de crescimento). Serão ressuspensos em meio básico (sem EGF) e solução de congelamento (proporção 1/1).
- Células de sementes colocando 100 μL da suspensão de células/meios de 600 μL no centro de seis lamínulas revestidas (consulte a etapa 5) da placa de 24 poços. Coloque a placa com cuidado na incubadora e deixe as células assentarem.
NOTA: 100 μL da suspensão celular de 600 μL (colhida de um poço de uma placa de 12 poços) resultará em 90% -100% de confluência celular, o que é necessário para a transfecção.
- Verifique as células após 3 h para ver se elas se acomodaram na lamínula. Adicionar 400 μL de meio de crescimento suplementado com EGF.
NOTA: As células geralmente estão prontas para a transfecção no dia seguinte (Figura 3G). Se não forem confluentes (90%-100%), deixem-nas para outro dia. Se ainda não forem confluentes, não os use para transfecção. Se outras aplicações a jusante forem realizadas, como perfil de miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR ou western blot, as células precisam ser passadas para placas de 12 poços (proporção de 1:1; não é necessário tratamento em placa) e colhidas para extração de RNA/proteína.
