Isolando populações de células do tecido cerebral usando classificação de núcleos ativados por fluorescência

Abstract

Fonte: Mussa, Z., et al. Isolamento de populações de astrócitos humanos adultos do córtex recém-congelado usando classificação de núcleos ativados por fluorescência. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar e classificar núcleos de tecido cerebral humano recém-congelado usando classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS), que permite o estudo de diferentes populações de células para várias aplicações neurológicas.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação do tampão

NOTA: Se estiver realizando o sequenciamento de RNA downstream, trate completamente todos os espaços de trabalho e ferramentas com a solução de descontaminação de RNase para evitar a degradação do mRNA.

1. Prepare o tampão de lise.
   1. Dissolver em água destilada (H₂O) até 50 ml: 5,47 g de sacarose (0,32 M final), 250 μL de cloreto de cálcio 1 M (CaCl₂) (5 mM final), 150 μL de acetato de magnésio 1 M (Mg(CH₃COO)₂)(3 mM final), 10 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 500 mM (0,1 mM final), 500 μL de ácido tricrídrico 1 M (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM final), 50 μL de Triton X-100 (0,1% final) e 17 μL de ditiotreitol 3 M (DTT, 1 mM final, adicionar fresco) (consulte a Tabela de Materiais).
2. Prepare tampão de sacarose
   1. Dissolver o seguinte em H₂O destilado até 50 mL: 30,78 g de sacarose (1,8 M final), 150 μL de 1 M Mg(CH₃COO)₂ (3 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL de 3 M DTT (1 mM final, adicionar fresco).

2. Dissociação de tecido congelado em suspensão de núcleo único

1. Adicione 4 mL de tampão de lise gelada a um soprador de tecido de vidro de 7 mL (moedor) e mantenha no gelo. Disseque aproximadamente 200-400 mg do córtex adulto humano recém-congelado, dounce aproximadamente 50x e transfira o homogeneizado do tecido para um tubo de polipropileno ultracentrífugo de 12 mL.
2. Com uma pipeta de 5 mL, adicione 6,5 mL de tampão sacarose gelado no fundo do tubo de ultracentrífuga, tomando cuidado para não perturbar a camada entre a sacarose e o homogeneizado tecidual.
   NOTA: Se estiver processando amostras adicionais, equilibre cuidadosamente os tubos por peso, adicionando tampão de lise adicional à amostra mais leve. O balanceamento preciso dos tubos da ultracentrífuga é essencial para evitar danos ao rotor e garantir a rotação na velocidade adequada.

3. Ultracentrifugação

1. Ultracentrifugar o lisado a 24.400 rpm (101.814 × g) durante 1 h a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e os detritos sem perturbar o sedimento.
   nota: Um pellet pode não ser visível se começar com menos de 200 mg de tecido.
2. Adicione 600 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (livre de cálcio (Ca²⁺), magnésio (Mg²⁺)) ao pellet de núcleos e incube em gelo por 10 minutos antes de ressuspendê-lo.
3. Pipete para cima e para baixo 50 vezes para ressuspender o pellet de núcleos no gelo.
4. Use um hemocitômetro para visualizar os núcleos intactos ao microscópio e garantir que a concentração da ressuspensão esteja acima de 10⁵ núcleos/mL antes de prosseguir para a próxima etapa (combine 10 μL dos núcleos ressuspensos com 10 μL de azul de tripano).

4. Incubação de anticorpos

1. Para imunomarcar a amostra para classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS), adicione 500 μL do pellet de amostra ressuspenso, 490 μL de 1x PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ livre), 10 μL de albumina de soro bovino a 10% (BSA) (0,1% final), 1 μL de anticorpo anti-NeuN de camundongo conjugado a AF (Alexa fluor) 555 (NeuN-AF555, concentração final de 1: 1000), e 1 μL de anticorpo anti-PAX6 de camundongo conjugado à aloficocianina (PAX6-APC, concentração final de 1:1000).
   nota: Anticorpos alternativos conjugados a outros fluoróforos podem ser adicionados. Aqui, o anti-OLIG2 de camundongo conjugado ao AF488 (concentração de 1:1000) foi usado com resultados favoráveis.
2. Execute controles somente de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e de cor única para configurar os parâmetros de gating, usando uma pequena quantidade da amostra conforme necessário.
   1. Para realizar um controle de cor única AF555, adicione 20 μL do pellet de amostra ressuspenso, 970 μL de 1x PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ livre), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo NeuN-AF555 (concentração de 1:1000).
   2. Para realizar um controle de cor única APC, adicione 20 μL do pellet de amostra ressuspenso, 970 μL de 1X PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ livre), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo PAX6-APC (concentração de 1:1000).
   3. Para realizar o controle apenas DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidol), adicione 20 μL do pellet de amostra ressuspenso, 970 μL de 1X PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ livre) e 10 μL de 10% BSA (0,1% final) (DAPI será adicionado posteriormente, ver 4.4).
      nota: Se mais de dois anticorpos forem usados, recomenda-se realizar o controle de fluorescência menos um (FMO), além dos controles de cor única.
3. Incubar as amostras e os controlos com rotação na obscuridade durante 1 h a 4 °C.
4. Adicione DAPI em 1:1000 a todos os exemplos e controles e prossiga com a classificação.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS pH 7,2	Invitrogen	70013073
CLONE DE ANTICORPO ANTI-NEUN A60	Millipore	MAB377A5MI	anti-NeuN de camundongo conjugado a um composto fluorescente AF555 (excitação, 553 nm; emissão, 568 nm)
ANTICORPO ANTI-OLIG2 CLONE 211	Millipore	MABN50A4MI	anti-OLIG2 de camundongo conjugado a um composto fluorescente AF488 (excitação, 499 nm; emissão, 520 nm)
Albumina de soro bovino	pescador	BP9704-100
Câmara de contagem de linha brilhante	Hausser Científico	3110V
Cloreto de cálcio anidro	pescador	C614-3
Filtros de células, 40 μM	SP Scienceware	136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)	Invitrogen	D1306
Moedor de tecido Dounce	Wheaton	357542
Classificador FACS	BD Biociências		BD FACSAria III
Acetato de magnésio tetrahidratado	pescador	M13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTES	Novus	NBP234705J
Sacarose, certificado de cristal, ACS, 500 mg	pescador	S5500
SW 41 Ti Rotor de caçamba oscilante	Beckman Coulter	331362
Tris-HCl, Solução 1M, pH 8,0, Grau de Biologia Molecular, Ultrapuro	Thermo Científico	J22638AE
TritonX-100	pescador	BP151-500	surfactante não iônico em tampão de lise
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	Gibco	15250061
Ultracentrífuga	Beckman Coulter Optima XE-100	A94516
Tubos de ultracentrífuga PP 9/16 X 3-1/2	Beckman Coulter	331372
Água destilada ultrapura (livre de RNAse, DNAse)	Invitrogen	10977023	referido como água destilada
EDTA ultrapuro	Tecnologias da Vida	Rolamento 15576-028