Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Coleta de tecidos
- Prepare o tampão X do kit de dissociação neural adicionando beta-mercaptoetanol ao tampão X até uma concentração final de 0,067 mM (para 4 amostras, adicione 13,5 μl de beta-mercaptoetanol 50 mM a 10 ml de tampão X).
- Prepare a mistura enzimática 1 misturando 50 μl de enzima P com 1.900 μl de tampão X para cada amostra, conforme descrito no protocolo do kit de dissociação neural Por exemplo, para 4 amostras, misture 200 μl de enzima P com 7.600 μl de tampão X.
- Colocar o tampão X no banho-maria a 37 ºC.
- Coloque 2 ml de solução salina tamponada de Hank fria (HBSS) (sem Ca++ e Mg++) em um poço de uma placa de cultura estéril de 6 poços para cada amostra que será coletada e mantida em gelo para dissecção do tecido.
2. Dissociação Neural (1 hora)
- Corte cada amostra de tecido em pedaços pequenos usando lâminas de barbear estéreis na tampa da placa de cultura de 6 poços. Este protocolo tem sido usado para amostras de tecido de aproximadamente 30 a 100 mg, mas é aprovado para amostras de tecido de até 400 mg. Para amostras de tecido maiores que 400 mg, os volumes de reagente devem ser aumentados adequadamente.
- Utilizar 1 ml de HBSS fresco sem Ca2+ e Mg2+ para transferir os pedaços de tecido em cubos com uma pipeta para um tubo de centrifugação estéril de 2 ml. Repita as etapas 2.1 e 2.2 para todas as amostras até que todas as amostras tenham sido transferidas para um tubo de centrífuga de 2 ml.
- Centrifugar as amostras a 300 x g durante 2 min a RT e aspirar o sobrenadante.
- Adicione 1.900 μl de Mistura de Enzimas 1 quente, conforme preparado nas Etapas 1.2 e 1.3, a cada amostra e feche os tubos.
- Incubar as amostras por 15 min em banho-maria a 37 ºC, invertendo os tubos várias vezes a cada 5 min para ressuspender os pedaços de tecido sedimentados.
- Enquanto isso, prepare a mistura de enzimas 2 misturando 20 μl de tampão Y com 10 μl de enzima A descongelada (para 4 amostras, misture 80 μl de tampão Y com 40 μl de enzima A descongelada).
- Adicione 30 μl de Enzyme Mix 2 a cada amostra e inverta suavemente. Não vórtice.
- Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "1", triturando para cima e para baixo 30 vezes.
- Incubar as amostras durante 15 min em banho-maria a 37 ºC; inverter os tubos várias vezes de 5 em 5 min para ressuspender os pedaços de tecido sedimentados.
- Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "2", triturando para cima e para baixo 30 vezes, evitando gerar bolhas.
- Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "3", triturando para cima e para baixo 30 vezes, evitando gerar bolhas.
- Incubar as amostras durante 10 min em banho-maria a 37 ºC; inverter os tubos várias vezes de 5 em 5 min para ressuspender as células sedimentadas.
- Aplique a suspensão de célula única a uma cepa de célula de 80 mícrons colocada em cima de um tubo de falcão de 15 ml para remover quaisquer pedaços grandes de detritos e lave o filtro e as células com 10 ml de HBSS (com Ca2+ e Mg2+) para interromper as reações enzimáticas. Repita até que cada amostra seja transferida para um tubo de falcão limpo de 15 ml.
- Centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 min em RT e aspirar o sobrenadante.
3. Depleção de Mielina (45 min)
- Ressuspenda completamente o pellet de células com 400 μl de tampão de remoção de mielina.
- Adicione uma quantidade especificada de grânulos de remoção de mielina e pipete para cima e para baixo para misturar bem.
nota: O volume de grânulos de remoção de mielina usados dependerá do tamanho do tecido, da idade do animal e da quantidade de mielina esperada nessa região específica do cérebro. Por exemplo, para uma amostra de hipocampo de rato adulto (aproximadamente 300 mg), incube a amostra com 100 μl de esferas de remoção de mielina.
- Incubar durante 15 min no frigorífico a 4 ºC.
- Lave cada amostra com 5 ml de tampão de remoção de mielina.
- Centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 min a RT.
- Enquanto centrifuga as amostras, coloque 1 coluna para cada amostra no campo magnético do classificador magnético e coloque um filtro limpo de 80 mícrons no topo de cada coluna.
- Preparar as colunas e filtrar enxaguando cada coluna com 1 ml de tampão de remoção de mielina três vezes (3 ml no total). Colete todo o fluxo em um recipiente de lixo, como o fundo de uma caixa de basculamento vazia.
- Posicionar um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml directamente por baixo de cada coluna na preparação da colheita da amostra.
- Quando as células terminarem a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo completamente em 500 μl de tampão de remoção de mielina. Aplique imediatamente a suspensão celular na coluna e recolha as células no tubo abaixo.
- Lave o filtro e a coluna com 1 ml de tampão de remoção de mielina, 4 vezes (4 ml no total).
- Centrifugar a recolha de células a 300 x g durante 10 min à RT.
- Aspire o sobrenadante e as células estão prontas para a coloração.
4. Coloração de células vivas para FACS (1 hora para coloração)
- Agite brevemente (2 seg) as células para separar o pellet e adicione imediatamente 5 μl de bloco Fc (anti-clusters de diferenciação 32, CD32), vórtice novamente e incube na geladeira a 4 ºC por 5 min.
- Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos primários adicionando os três anticorpos primários no tampão de lavagem da seguinte forma: 0,125 μl de anticorpo CD11b conjugado com aloficocianina (APC) (1:800), 1 μl de anticorpo anti-GLT1 (1:100) e 0,4 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC) – anticorpo Thy1 conjugado (1:250) para cada 100 μl de tampão de lavagem. Cada amostra receberá 100 μl de mistura de anticorpos primários para incubação; no entanto, se sua amostra for muito maior que 400 mg de tecido, você pode considerar aumentar o volume de sua mistura de anticorpos primários de acordo
- Prepare os tubos para controles de coloração única removendo apenas 2 μl de células de cada tubo de amostra e adicionando-o a cada tubo de controle de coloração único. Os controles de "coloração única" incluem: apenas APC-CD11b, apenas GLT1, apenas FITC-Thy1, apenas anticorpo secundário PE e o controle "em branco" ou não corado.
nota: Todas as amostras devem ser representadas em todos os controles de coloração, portanto, 2 μl de células de cada amostra devem ser adicionados a cada tubo de controle de coloração.
- Vortex breve dos tubos (2 segundos) e adicione 100 μl de mistura de anticorpos primários a cada tubo de amostra e 100 μl de anticorpo primário apropriado a cada tubo de controle de coloração, vórtice os tubos novamente, cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes de qualquer luz e incube os tubos na geladeira a 4 ºC por 20 min. As amostras devem ser mantidas frescas (a 4 ºC) durante o resto do procedimento, a fim de manter a integridade das amostras e dos anticorpos.
- Agite brevemente os tubos e adicione 2 ml de tampão de lavagem a cada tubo.
- Tubos de centrífuga a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.
- Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos secundários adicionando 0,2 μl de anticorpo secundário anti-coelho conjugado com PE para cada 100 μl de tampão de lavagem. Cada amostra receberá 100 μl de mistura de anticorpos secundários; No entanto, se sua amostra for muito maior que 400 mg de tecido, você pode considerar aumentar o volume de sua mistura de anticorpos primários de acordo.
- Quando a centrifugação estiver concluída, despeje o sobrenadante de cada amostra na pia e seque os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel.
- Submeter brevemente os tubos em vórtice e adicionar 100 μl de mistura de anticorpos secundários a cada tubo de amostra e o anticorpo secundário adequado a cada controlo de coloração. Em seguida, vórtice os tubos novamente, cubra-os com papel alumínio e incube-os na geladeira a 4ºC por 15 min.
nota: O tubo de controle de coloração somente GLT1 deve receber a mistura de anticorpos secundários.
- Após a incubação, vórtice breve os tubos e adicione 2 ml de tampão de lavagem a cada tubo.
- Centrifugue os tubos a 350 x g durante 5 min a 4ºC.
- Quando a centrifugação estiver concluída, despeje o sobrenadante de cada amostra na pia e seque os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel.
- Vortex os tubos e adicione 0,25 ml de PBS estéril a cada tubo. As amostras estão prontas para classificação.
nota: Mais células podem exigir 0,5 ml de PBS estéril; No entanto, é melhor começar com um volume menor, pois a amostra sempre pode ser diluída se estiver muito concentrada com células.
nota: Opcionalmente, adicione DNase ao tubo para evitar que as células se aglomerem e, assim, entupam o classificador. As amostras também podem ser filtradas usando um filtro estéril de 80 mícrons antes da classificação para evitar entupir o classificador.
