1. Preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular
- Colete vermes e prepare tampões para o isolamento celular.
- Colete os vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7,0) e centrifugue por 5 min a 1.600 x g. Descarte o sobrenadante e lave os vermes com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover o máximo possível de contaminação por Escherichia coli.
NOTA: A adição de antibióticos (50 μg/mL), como a ampicilina, nesta etapa pode ajudar a reduzir a contaminação bacteriana.
- Para duas amostras, prepare 2 mL de tampão de lise dodecil sulfato-ditiotreitol de sódio (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (p / v) SDS, 20 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico) (pH 8,0) e 3% (p / v) sacarose.
- Prepare 15 mL de tampão de isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) e armazene-o em gelo.
nota: Tanto o tampão de lise SDS-DTT quanto o tampão de isolamento devem ser renovados antes de cada experimento.
- Ruptura da cutícula e isolamento de célula única
- Centrifugar animais coletados na etapa 1.1.1 por 5 min a 1.600 x g. Remova todos os sobrenadantes e suspenda os vermes em 1 mL de meio M9 e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Vermes de pellets com centrifugação a 1.600 x g por 5 min.
- Adicione 200 μL de tampão de lise SDS-DTT aos vermes e incube por 5 min em temperatura ambiente (RT). Os vermes devem parecer "enrugados" ao longo do corpo se vistos ao microscópio de luz.
nota: A exposição prolongada ao tampão de lise SDS-DTT pode resultar na morte de vermes, que pode ser monitorada pela observação de vermes. Os vermes mortos se alongam e não se enrolam.
- Adicione 800 μL de tampão de isolamento gelado e misture sacudindo suavemente o tubo.
- Vermes de pellets por 1 min a 13.000 x g a 4 ° C, remova o sobrenadante e lave com 1 mL de tampão de isolamento.
- Repita a etapa 1.3.5 por um total de cinco vezes, removendo cuidadosamente o buffer de isolamento a cada vez.
- Adicione 100 μL de mistura de protease de Streptomyces griseus (15 mg / mL) (Tabela de Materiais) dissolvida em tampão de isolamento ao pellet e incube por 10 a 15 min em RT.
nota: Tal como acontece com o tampão de lise SDS-DTT, a digestão prolongada da protease pode resultar em clivagem excessiva de proteínas ao longo da membrana plasmática, impedindo o isolamento da proteína fluorescente verde exposta à superfície (GFP) por meio de esferas magnéticas.
- Durante a incubação com mistura de protease, aplique a interrupção mecânica pipetando as amostras para cima e para baixo contra o fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com uma ponta de micropipeta de 200 μL por ~ 60 a 70 vezes. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo da microcentrífuga com pressão constante para dissociar adequadamente as células.
- Para determinar o estágio da digestão, remova um pequeno volume (~ 1−5 μL) da mistura de digestão, coloque-a em uma lâmina de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura de tecidos. Após 5 a 7 minutos de incubação, os fragmentos de vermes devem ter cutícula visivelmente reduzida e uma pasta de células será facilmente visível.
- Reação de interrupção com 900 μL de meio L-15 de Leibovitz frio comercialmente disponível suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina (concentração final a 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina).
- Fragmentos e células isolados de pellets por centrifugação por 5 min a 10.000 x g a 4 ° C. Lave as células peletizadas com 1 mL de meio suplementado com L-15 frio mais duas vezes para garantir que o excesso de detritos e cutícula seja removido.
- Ressuspenda as células peletizadas em 1 mL de meio suplementado com L-15 e deixe no gelo por 30 min. Leve a camada superior, aproximadamente 700−800 μL, para um tubo de microcentrífuga. Esta camada contém células sem detritos celulares e será usada no isolamento subsequente de células de interesse.
- Seguindo as instruções do fabricante, use um contador de células automatizado ou hemocitômetro para medir a densidade celular de 10 a 25 μL de células isoladas.
2. Isolamento de células GFP-positivas via citometria de fluxo
- Isolamento de células GFP-positivas por citometria de fluxo
- A partir da suspensão de células isoladas recolhida no passo 1.2.12, centrifugar as células durante 5 min a 10 000 x g a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e suspender as células peletizadas em meio suplementado com L-15 até obter uma densidade celular não superior a 6 x 106 células/ml para evitar sobrecarregar o citómetro de fluxo.
- Classificar as células por expressão positiva para GFP usando um citômetro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como controle para análise não específica do tipo de célula.
- Cultura de células isoladas
- Células isoladas em uma placa estéril de 6 poços com vários poços.
nota: Essas placas podem ser revestidas com lectina de amendoim para aumentar a fixação celular; No entanto, se as células forem usadas imediatamente, esta etapa pode ser desconsiderada.
- Coloque a placa em um recipiente de plástico e incube as células a 20 ° C com um pano úmido ou lenço de papel macio (adicione 50 μg / mL de ampicilina à água destilada duplamente [ddH2O] para garantir que não haja crescimento bacteriano na limpeza) para adicionar umidade às células. Não incube em uma incubadora de CO2, pois níveis elevados de CO2 podem danificar as células.
