Obtenção de fatias de cerebelo de um cérebro embrionário de pintinho

Resumo

Fonte: Hanzel, M., et al. Ex Vivo Cultura de Fatias Cerebelares de Pintinhos e Eletroporação Espacialmente Direcionada de Precursores de Células Granulares. J. Vis. Exp. (2015).

O vídeo demonstra a preparação de fatias de cerebelo. Ele mostra um procedimento detalhado para isolar o cerebelo de um embrião de galinha. As fatias são então preparadas a partir do cerebelo dissecado usando um cortador de tecidos para posterior análise experimental.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecção de Embrião de Galinha Dia 14 (e14) Cerebelo

1. Incubar ovos de galinha fertilizados castanhos a 38 °C até ao dia 14 embrionário.
2. Usando uma tesoura de ovo, decapite o embrião do pintinho in ovo e remova a cabeça para uma placa de Petri contendo solução salina tampão fosfato gelada (PBS) (Figura 1A).
3. Usando uma pinça padrão, faça incisões atrás de cada olho em todo o tecido, removendo os olhos e a mandíbula superior. Faça uma segunda incisão em toda a faringe, removendo a mandíbula inferior (Figura 1B).
4. Usando uma pinça padrão, remova toda a pele da superfície de um crânio retirando-a (Figura 1C) e remova os ossos frontal e parietal, revelando o cérebro.
5. Do ponto de vista ventral, remova a cartilagem faríngea e o mesênquima auxiliar.
6. Do ponto de vista dorsal, remova cuidadosamente o mesênquima dorsal ao rombencéfalo, tomando cuidado para não danificar a pia, e separe todo o cérebro (Figura 1D).
7. Faça uma incisão em todo o tecido entre o mesencéfalo e o rombencéfalo e separe o rombencéfalo, incluindo o cerebelo (Figura 1E).
8. Remova todo o cerebelo fazendo incisões em todo o tecido em ambas as junções laterais do cerebelo e na placa alar do rombencéfalo, tomando cuidado para manter a integridade da pia durante a dissecção (Figura 1F). Além disso, remova o plexo coróide em formação (Figura 1G).
9. Mova o cerebelo dissecado para a solução salina balanceada de Hank (HBSS) gelada.

2. Cultura de fatias de e14 Cerebelo

1. Transfira todo o cerebelo para a plataforma estéril de um picador de tecidos usando uma espátula ou uma pipeta Pasteur de 3 ml com a ponta cortada para ampliar a abertura. Remova o excesso de líquido usando uma pipeta.
2. Corte todo o cerebelo inteiro na orientação desejada com 300 μm de espessura usando o conjunto picador de tecidos com uma velocidade de corte de 50% do máximo. A integridade do tecido é mais facilmente preservada na secção sagital; no entanto, a orientação também é uma consideração importante para a análise celular (os dendritos das células de Purkinje são alinhados sagitalmente, enquanto os axônios das células granulares correm transversalmente, perpendicularmente ao plano dos dendritos das células de Purkinje).
3. Usando uma pipeta Pasteur de 3 ml, cubra o cerebelo fatiado em HBSS gelado.
4. Transferir as fatias em HBSS para uma placa de Petri de 60 mm com HBSS fresco e gelado, utilizando uma pipeta Pasteur de 3 ml com uma ponta cortada.
5. Sob um microscópio de dissecação iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica, certifique-se da separação das fatias individuais usando uma pinça de relojoeiro.
   nota: Cada dissecção, desde a incubação do embrião até a fatia em meio de cultura, leva cerca de 10 a 20 minutos, dependendo da experiência. Realize dissecações uma de cada vez para garantir que o cerebelo passe o mínimo de tempo entre a decapitação e a cultura ex vivo.

Resultados

Figura 1. Dissecção do cerebelo de embriões de pintos E14. (A) Decapite o filhote no ovo e remova a cabeça para uma placa de Petri com PBS gelado. Remova a mandíbula inferior e os olhos fazendo uma incisão atrás dos olhos e da faringe (linha tracejada). (B) Remova a pele da superfície do crânio. (C) Remova os ossos frontal e parietal e (D) remova o cérebro do mesênquima e da cartilagem que o cerca...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
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