Estabelecimento de culturas primárias de células gliais mistas a partir de uma medula espinhal de camundongo

Resumo

Fonte: Malon, J. T., et al. Preparação de Culturas Gliais Mistas Primárias de Tecido da Medula Espinhal de Camundongos Adultos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células gliais mistas primárias do tecido da medula espinhal de camundongos adultos. O protocolo envolve a digestão enzimática do tecido, seguida pela remoção de membranas celulares quebradas e detritos de mielina para obter uma população unicelular. As células são então cultivadas em meios otimizados para o crescimento de células gliais mistas.

Protocolo

1. Preparação de soluções em uma capela de cultura sob condições assépticas

1. Preparar meios de cultura: completar a modificação de Dulbecco do meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM (com 4,5 g/L de glicose), 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B e 50 μM de 2-mercaptoetanol (2-ME; ver 1.1.1). Misture e filtre, esterilize todos os outros componentes e, em seguida, adicione FBS. Conservar os meios de cultura a 4 ^°C.
   1. Prepare 50 mM de solução salina tamponada com fosfato (PBS): adicione 100 μL de 2-ME concentrado (14,3 M) em 28,6 mL de 1x PBS e esterilize com filtro (a solução pode ser armazenada a 4 ^° C por vários meses). Use 1 mL de solução estoque 2-ME para cada 1.000 mL de meio de cultura.
2. Preparação do meio de gradiente de densidade
   1. Prepare uma solução de mídia de gradiente de densidade isotônica de estoque (por exemplo, 100% Percoll) de 1 parte de PBS estéril regular 10x e 9 partes de mídia de gradiente de densidade de estoque estéril (por exemplo, Percoll).
   2. Dilua o meio de gradiente de densidade de 100% (feito em 1.2.1) com PBS estéril regular 1x para fazer um meio de gradiente de densidade de 20% (por exemplo, 10 mL de meio de gradiente de densidade de 100% com 40 mL de PBS 1x) e armazene-o a 4 ^°C. Leve o meio de gradiente de densidade de 20% à temperatura ambiente (RT) antes de preparar a cultura de células.
3. Preparação de soluções a partir do sistema de dissociação da papaína
   NOTA: O sistema de dissociação da papaína pode ser identificado na Tabela de Materiais. Outros kits de dissociação semelhantes (incluindo aqueles montados internamente) também podem ser usados. Todos os componentes devem ser estéreis.
   1. Adicione 32 mL de solução salina balanceada de Earle (EBSS) à mistura de inibidores de ovomucóide (pó).
   2. Adicione 5 ml de EBSS a um frasco para injetáveis de papaína (pó). Colocar o frasco para injetáveis de papaína num banho-maria a 37 ^°C durante 10 min ou até que a papaína esteja dissolvida.
   3. Adicione 500 μL de EBSS a um frasco para injetáveis de DNase (pó). Misture delicadamente.
   4. Adicione 250 μL da solução de DNase (acima) ao frasco para injetáveis de papaína.
   5. Calcule a quantidade total necessária da mistura de papaína/DNase acima (aproximadamente 800 μL de mistura de papaína/DNase por medula espinhal de camundongo) e transfira a mistura necessária para um tubo de 50 mL para digestão do tecido. Conservar o resto no frasco de origem a 4 °C durante pelo menos duas semanas.
   6. Mantenha todos os componentes dos kits no gelo até que sejam necessários.
4. Prepare os tubos de coleta da medula espinhal: um tubo estéril de 15 mL com 5 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS; do sistema de dissociação da papaína, para coleta da medula espinhal) e um tubo estéril de 15 mL com 1x PBS (para encher a seringa de 5 mL). Além disso, prepare uma placa de Petri estéril (35 mm ou 60 mm) com 5 mL de HBSS e mantenha-a na capela de cultura.

2. Preparação da suspensão unicelular

Nota: Execute as etapas 3 e 4 em uma capa de cultura para manter tudo estéril.

1. Transfira todas as medulas espinhais para a placa de Petri contendo HBSS. Corte cada uma das medulas espinhais em muitos pedaços pequenos e finos com tesouras e pinças estéreis. Transfira o tecido da medula espinhal para o tubo cônico de 50 mL contendo a mistura enzimática preparada de papaína/DNase (etapa 1.3.5) usando uma pinça estéril ou uma pipeta de 10 mL (evite adicionar HBSS à mistura enzimática, pois isso diluirá ainda mais a solução enzimática preparada e pode resultar em diminuição do desempenho da enzima).
2. Vortex o tubo suavemente para misturar. Incubar o tubo a 37 ^oC durante 1 h numa incubadora/agitador com agitação orbital a 150 rpm.
3. Vortex o tubo novamente e triturar vigorosamente a solução enzimática com o tecido usando uma pipeta de 5 mL para promover uma maior dissociação.
4. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugue a 300 x g durante 5 min a RT.
5. Durante a centrifugação, misturar 2,7 ml de EBSS com 300 μl de solução reconstituída de inibidor de albumina-ovomucóide (1.3.1) num tubo estéril. Adicionar 150 μL da solução de DNase (passo 1.3.3).
6. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com a solução acima preparada (passo 1.5). Vórtice bem para quebrar o pellet celular.
7. Adicione 3 mL de solução reconstituída de inibidor de albumina-ovomucóide (etapa 1.4.1) à suspensão celular. Centrifugue as células a 70 x g durante 6 min à RT. Retire o sobrenadante (que contém fragmentos de membrana).

3. Remoção adicional de mielina da suspensão de célula única

1. Adicione 8 mL de meio de gradiente de densidade de 20% (preparado na etapa 1.2.2) no tubo que contém o pellet celular, vortex suavemente para romper o pellet e centrifugue as células a 800 x g por 30 min em RT sem frear. Remova cuidadosamente a camada superior de detritos (principalmente mielina) e o sobrenadante, mas mantenha o pellet.
2. Para remover os restos do gradiente de densidade, lave as células ressuspendendo o pellet celular com 8 mL de um cDMEM diluído (1 parte de cDMEM e 2 partes de HBSS). Centrifugar as células a 400 x g durante 10 min a 4 ^oC. Retirar o sobrenadante e lavar novamente as células com o cDMEM diluído (acima) do mesmo modo. Mantenha as células no gelo até semeá-las.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em meios de cultura (cDMEM fornecido com 2-ME (preparado no passo 1.1)). Para uma placa de 12 poços, use 3 mL x 4 (número de camundongos usados) + 2 mL = 14 mL de meio. Isso garantirá que haja suspensão de células suficiente para toda a placa (12 poços) e fornecerá poços extras que podem ser usados para determinar o número médio de células por poço e o conteúdo microglial da cultura. Se outros tipos de recipientes de cultura forem usados, calcule o volume total de meios de cultura necessários proporcionalmente.
4. Adicione 1 mL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 12 poços.
5. Incubar as células a 35,9 ^oC com 5% de CO₂.
6. Altere a mídia (remova a mídia antiga por aspiração) em D 1 e depois a cada 3 - 4 dias (normalmente altere a mídia em D: 1, 4, 8 e 11 e, em seguida, use as células no dia 12).
   nota: No dia 1, a cultura pode conter quantidades significativas de detritos devido ao resíduo de mielina do tecido da medula espinhal; portanto, recomenda-se alterar a mídia no dia 1. As culturas estão prontas para tratamento entre D 12 - 14. As células geralmente são 80% confluentes em D 12 e podem estar perto de 100% confluentes em D 14. Normalmente, no D 12, há cerca de 100.000 células por poço em uma placa de 12 poços.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Modificação de Dulbecco do meio de Eagle (DMEM) com 4,5 g/L de glicose	Lonza	12-709F	O meio cDMEM é um meio de cultura padrão e amplamente utilizado. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar o DMEM e todos os outros componentes usados para fazer a mídia cDMEM.
L-Glutamina (100x)	Lonza	17-605E	A L-glutamina é um componente padrão e amplamente utilizado para vários meios de cultura. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar L-glutamina.
Solução antibiótico-antimicótica (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Esta é uma combinação de penicilina, estreptomicina e anfotericina formulada para conter 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar componentes individuais.
2-mercaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	Um BioReagente, adequado para cultura celular, biologia molecular e eletroforese.
Sistema de dissociação de papaína	Corporação Bioquímica Worthington	LK003150	Os componentes individuais deste kit podem ser adquiridos separadamente.
Percoll	GE Cuidados de Saúde	17-0891-01	Percoll é vendido como solução estéril. O Percoll não diluído pode ser autoclavado novamente, se necessário.
Incubadora/agitadora Lab-line	Barstead / linha de laboratório	MaxQ4000	Esta é a incubadora/agitadora que temos atualmente. Outros tipos de agitadores podem ser usados em seu lugar.