Estabelecimento de culturas primárias de células gliais mistas a partir de uma medula espinhal de camundongo

Resumo

Fonte: Malon, J. T., et al. Preparação de Culturas Gliais Mistas Primárias de Tecido da Medula Espinhal de Camundongos Adultos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células gliais mistas primárias do tecido da medula espinhal de camundongos adultos. O protocolo envolve a digestão enzimática do tecido, seguida pela remoção de membranas celulares quebradas e detritos de mielina para obter uma população unicelular. As células são então cultivadas em meios otimizados para o crescimento de células gliais mistas.

Protocolo

1. Preparação de soluções em uma capela de cultura sob condições assépticas

1. Preparar meios de cultura: completar a modificação de Dulbecco do meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM (com 4,5 g/L de glicose), 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B e 50 μM de 2-mercaptoetanol (2-ME; ver 1.1.1). Misture e filtre, esterilize todos os outros componentes e, em seguida, adicione FBS. Conservar os meios de cultura a 4 ^°C.
   1. Prepare 50 mM de solução salina tamponada com fosfato (PBS): adicione 100 μL de 2-ME concentrado ....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Modificação de Dulbecco do meio de Eagle (DMEM) com 4,5 g/L de glicose	Lonza	12-709F	O meio cDMEM é um meio de cultura padrão e amplamente utilizado. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar o DMEM e todos os outros componentes usados para fazer a mídia cDMEM.
L-Glutamina (100x)	Lonza	17-605E	A L-glutamina é um componente padrão e amplamente utilizado para vários meios de cultura. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar L-glutamina.
Solução antibiótico-antimicótica (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	Esta é uma combinação de penicilina, estreptomicina e anfotericina formulada para conter 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar componentes individuais.
2-mercaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	Um BioReagente, adequado para cultura celular, biologia molecular e eletroforese.
Sistema de dissociação de papaína	Corporação Bioquímica Worthington	LK003150	Os componentes individuais deste kit podem ser adquiridos separadamente.
Percoll	GE Cuidados de Saúde	17-0891-01	Percoll é vendido como solução estéril. O Percoll não diluído pode ser autoclavado novamente, se necessário.
Incubadora/agitadora Lab-line	Barstead / linha de laboratório	MaxQ4000	Esta é a incubadora/agitadora que temos atualmente. Outros tipos de agitadores podem ser usados em seu lugar.