Diferenciação de células progenitoras óticas em células epiteliais sensoriais seguidas de imunomarcação

Resumo

Fonte: Azadeh, J. et al., Iniciando a diferenciação em células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas.J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a diferenciação de células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) em células epiteliais sensoriais. Ele descreve as etapas envolvidas na cultura de células iMOP, formação de otosferas, indução de diferenciação e visualização de componentes celulares e marcadores de diferenciação por meio de microscopia de fluorescência para confirmar a diferenciação celular bem-sucedida.

Protocolo

1. Mantendo a auto-renovação em células IMOP

1. Prepare meios de cultura iMOP: DMEM/F12, suplemento 1X B27, 25 μg/ml de carbenicilina e 20 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF). Faça 50 ml de meio de cultura iMOP usando reagentes estéreis. Aquecer 49 ml de DMEM/F12 num cónico de 50 ml em banho-maria a 37 °C.
   1. Descongele o suplemento 50X B27 e alíquotas de carbenicilina 100 mg/ml esterilizadas por filtro por 5 min em banho-maria a 37 °C. Descongelar 100 μg/ml de alíquota de bFGF em RT. Adicionar 1 ml de 50X B27, 10 μl de 100 μg/ml de bFGF e 12,5 μl de carbenicilina 100 mg/ml em DMEM/F12.
2. Utilizar 3 ml de meio numa placa de cultura de tecidos de 60 mm para a cultura de células iMOP. Adicione novas mídias às culturas a cada dois dias, dobrando o volume de mídia. Certifique-se de que a concentração de bFGF não caia abaixo de 5 ng/ml.
   1. Cultura de células iMOP a 37 °C com 5% de CO_2. Células de passagem em cultura após 5 a 7 dias, conforme listado nas etapas abaixo. Transferir a cultura para uma cónica de 15 ml utilizando uma ponta de pipeta de 10 ml.
3. Faça 1 mM de EDTA em HBSS diluindo 0,1 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 em 50 ml de HBSS. Pré-aquecer 1 mM de EDTA feito em HBSS em banho-maria a 37 °C.
4. Colher células por sedimentação por gravidade ou centrifugação a 200 x g durante 5 min a RT. Para a sedimentação por gravidade, colocar a cónica de 15 ml que contém as culturas na incubadora a 37 °C durante 5 a 10 min. Após esse tempo, observe as otosferas coletadas no fundo da cônica de 15 ml.
   nota: A força centrífuga excessiva pode causar danos às células.
5. Aspire cuidadosamente os meios usados usando uma pipeta de aspiração de 2 ml sem perturbar o pellet celular. Adicione 0,5 ml de solução EDTA HBSS 1 mM pré-aquecida ao pellet celular. Usando uma pipeta P1000, pipete suavemente para cima e para baixo 2 a 3 vezes. Coloque o cônico a 37 ° C e incube por <5 min para facilitar a dissociação em células individuais.
6. Agite suavemente a solução celular para determinar se as otosferas estão dissociadas. Se nenhuma otosfera sedimentar no fundo da cônica, as células são dissociadas. O tempo de incubação pode variar.
   nota: A incubação prolongada com EDTA resultará em morte celular excessiva.
7. Remover as células a 37 °C, adicionar 2 ml de meio para neutralizar e diluir o EDTA. Colete as células por centrifugação a 200 x g por 5 min em RT. Aspire o EDTA diluído usando uma pipeta de aspiração de 2 ml e adicione 5 ml de PBS 1X para lavar as células.
8. Gire as células a 200 x g por 5 min em RT e aspire 1X PBS usando uma pipeta de aspiração de 2 ml. Ressuspenda as células usando uma pipeta P1000 em 0,5 ml de meio de cultura iMOP, pipetando suavemente para cima e para baixo 2 a 3 vezes.
9. Conte as células usando um contador de partículas microfluídicas com os apropriados. Uma placa confluente de células iMOP conterá ~ 6 células X10⁶. Diluir as células 1:100 em meio e adicionar 75 μl de solução celular no para contagem. Placa 1 x 10⁶ células em um prato de 6 cm em meio de cultura iMOP (diluição ~ 1:10). Passagem de iMOPs a cada 5 - 7 dias.
   nota: As células que formam grandes otosferas ou se ligam ao fundo da placa de cultura de tecidos se diferenciam. As células também morrerão se as culturas forem superconfluentes.

2. Diferenciando células IMOP em epitélio sensorial

1. Prepare 50 ml de meios de diferenciação de epitélios sensoriais iMOP: DMEM/F12, suplemento 1X B27, 25 μg/ml de carbenicilina. Faça 50 ml de meio de diferenciação de epitélios sensoriais iMOP. Aquecer 49 ml de DMEM/F12 num cónico de 50 ml em banho-maria a 37 °C. Descongelar o suplemento 50X B27 e alíquotas de carbenicilina 100 mg/ml durante 5 min. em banho-maria a 37 °C. Adicione 1 ml de 50X B27 e 12,5 μl de carbenicilina 100 mg / ml em DMEM / F12.
2. Para colher, dissociar, ressuspender e contar células, repita as etapas 1.4 a 1.9
3. Placa 1 x 10⁶ células em um prato de 6 cm no Dia -3 usando meio de cultura iMOP. No dia 0, transfira as culturas usando uma pipeta de 10 ml para uma cônica de 15 ml. Colete as otosferas por sedimentação por gravidade, conforme indicado na etapa 1.6. Aspirar os meios usados com uma pipeta de aspiração de 2 ml e deixar as otosferas no fundo da cónica.
4. Adicione suavemente 2 ml de meio de diferenciação do epitélio sensorial. Transferir as otosferas para uma placa de 6 cm usando uma pipeta de 10 ml de diâmetro grande.
   nota: O cisalhamento mecânico de pipetagem áspera pode dissociar as células das otosferas.
5. Adicionar 2 ml de meios de diferenciação epitelial sensorial frescos às culturas em dias alternados. Se necessário, as células podem ser coletadas por sedimentação por gravidade e substituídas por meios.
6. Colete as otosferas no dia 10, transferindo-as para uma cônica de 15 ml e permitindo que as otosferas sedimentem conforme indicado na etapa 1.6. Aspirar os meios usados com uma pipeta de aspiração de 2 ml e deixar as otosferas intactas.
7. Fixe as otosferas incubando em formaldeído a 4% em 1X PBS por 15 min em RT. Remova a solução de formaldeído e lave as otosferas com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de TritonX-100) antes de incubá-las em tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro de cabra normal e 0,1% de Triton X-100) por 1 hora.
   1. Substitua o tampão e incube as amostras no tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 °C. Lave as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 e submeta a otosfera à imunocoloração. Transfira as otosferas para 1X PBS e coloque as otosferas na mídia de montagem em uma lâmina de vidro usando uma pipeta P1000. Coloque uma lamínula sobre a amostra e deixe o suporte de montagem secar a 4 °C.
8. Adquira imagens de epifluorescência usando uma configuração de microscópio invertido equipada com uma câmera CCD de 16 bits e uma objetiva de imersão em óleo de 20X 0,75 ar ou 40X 1,3 NA. Colete fluorescência de diferentes canais de cores usando os comprimentos de onda listados (excitação e emissão): azul (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), vermelho (562 ± 20nm/ e 625 ± 20nm) e infravermelho (628 ± 20nm/ e 692 ± 20 nm).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 Espessura lamínula de vidro (redondo 12 mm)	Ciências da Microscopia Eletrônica	72230-01
DMEM/F12	Tecnologias da Vida	11320-082
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4	Tecnologias da Vida	10010-023
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Tecnologias da Vida	14025-092
Suplemento B27 (50X) Sem Soro	Tecnologias da Vida	Rolamento 17504-044	Conservadas sob a forma de alíquotas de 1 ml
Prolongar o Antifade Mountant Gold	Tecnologias da Vida	Rolamento 47743-736	Conservadas em alíquotas de 10 mg/ml de 100 μl
Moxi Z Mini Contador de Células Automatizado	Orflo	MXZ001
Moxi Z Tipo S	Orflo	MXC002
Fator de crescimento de fibroblastos murinos recombinantes, básico (bFGF)	Peprotech	450-33	Ressuspensa em BSA a 0,1% em H20 e armazenada como alíquotas de 20 mg/ml
Carpenicilina, sal dissódico	Thermo Fisher Científico	BP2648-1	Ressuspenso em Hepes 10mM pH 7,4 e armazenado como alíquotas de 100 mg/ml
Pipeta de 5 ml embalada individualmente (200/caixa)	Thermo Fisher Científico	1367811D
Pipeta de 10 ml embalada individualmente (200/caixa)	Thermo Fisher Científico	1367811E
Prato de 6 cm tratado com cultura de tecidos	Thermo Fisher Científico	130181
Pontas de pipeta de filtro TipOne 0,1-10 ponta de filtro alongada ul	EUA Científico	1120-3810
Pontas de pipeta de filtro TipOne 1-20 ul ponta de filtro	EUA Científico	1120-1810
Pontas de pipeta de filtro TipOne 1-200 ul ponta de filtro	EUA Científico	1120-8810
Pontas de pipeta de filtro TipOne 101-1000 ponta de filtro ul	EUA Científico	1126-7810
Tubos cônicos de 15 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)	EUA Científico	1475-0511
Tubos cônicos de 50 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)	EUA Científico	1500-1211