Diferenciando progenitores óticos multipotentes imortalizados em neurônios ganglionares espirais e avaliando a diferenciação

Resumo

Fonte: Azadeh, J., et al. Iniciando a diferenciação em células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas. J. Vis. Exp. (2016).

O vídeo demonstra a diferenciação de progenitores óticos multipotentes imortalizados (iMOPs) em neurônios ganglionares espirais (SGNs) e a confirmação da diferenciação baseada em imunofluorescência. Os iMOPs são plaqueados em lamínulas revestidas com substrato de cultura em um meio de diferenciação neuronal para diferenciação em SGNs. As células diferenciadas são marcadas com anticorpos específicos para marcadores de diferenciação neuronal e analisadas ao microscópio para confirmar a diferenciação.

Protocolo

1. Diferenciação de neurônios derivados de iMOP

1. Faça 50 ml de meios de diferenciação neuronal: Meios neurobasais, suplemento 1X B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongelar o frasco de 50X B27 e 200 mM de L-Glutamina em banho-maria a 37 °C durante 5 min. Adicione 1ml de 50X B27 e 0,5 ml de L-Glutamina 200 mM a 48,5 ml de meio neurobasal.
2. Cubra a lamínula colocando lamínulas redondas de 1,5 mm em uma placa estéril de 10 cm e adicione etanol a 70% (EtOH) à placa para esterilizar e limpar as lamínulas.
3. Agite suavemente as lamínulas para garantir que estejam cobertas com etanol. Deixe a placa por 10 min em RT. Enxágue as lamínulas 3 vezes com solução salina estéril 1X tamponada com fosfato (PBS) para lavar o etanol restante. Enxágue a lamínula uma vez com H₂O estéril para lavar o 1X PBS restante.
4. Aspirar o H₂O com uma pipeta de aspiração de 2 ml e deixar secar as lamínulas. Exponha as lamínulas à luz ultravioleta na capa de cultura de tecidos por 15 min. Armazene as lamínulas em um ambiente estéril se não forem usadas imediatamente.
5. Coloque uma lamínula redonda de 12 mm em cada poço de um prato de 24 poços. Agite a placa suavemente para garantir que as lamínulas fiquem planas no fundo do poço.
6. Descongelar 2 mg/ml de solução de reserva de poli-D-lisina à temperatura ambiente (RT) e diluir até uma concentração de 10 μg/ml de poli-D-lisina em 1X PBS. Adicione 0,25 ml de 10 ug/ml de poli-D-lisina aos poços. Deixe a placa na incubadora a 37 °C por 1 hora.
7. Lave os poços 3 vezes com PBS 1X estéril. Descongele 10 mg / ml de solução estoque de laminina em RT e dilua para 10 μg / ml em 1X PBS. Adicione 0,25 ml de solução de trabalho de laminina de 10 μg / ml em um único poço de um prato de 24 poços múltiplos. Incubar a placa a 37 °C incubadora. Aspirar a solução de laminina com uma pipeta de aspiração de 2 ml.
8. Lave a lamínula 3 vezes com 1X PBS adicionando 1 ml de 1X PBS com uma pipeta P1000 e removendo o 1X PBS aspirando com uma pipeta de aspiração de 2 ml. Deixe 1X PBS da última lavagem no poço até que as células estejam prontas para serem plaqueadas. Inicie a diferenciação neuronal colhendo, dissociando e contando células. Placa 1 x 10⁶ células em um prato de 6 cm no Dia -3.
9. No Dia 0, colhe, dissocie e conte as células. Semeie 1 x 10⁵ - 1,5 x 10⁵ células iMOP em 0,5 ml de meio de diferenciação neuronal pré-aquecido por poço em um prato de 24 poços. Aspire e adicione meios de diferenciação neuronal pré-aquecidos às culturas em dias alternados.
10. Fixe os neurônios derivados de iMOP em formaldeído a 4% por 15 min. Remova a solução de formaldeído, lave os neurônios derivados de iMOP com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de TritonX-100) antes de incubar em tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro de cabra normal e 0,1% de Triton X-100) por 1 hora.
    1. Substitua o tampão e incube as amostras no tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 °C. Lave as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 sujeitam as células à imunocoloração. Lave a lamínula com 1X PBS antes de colocá-la na mídia de montagem. Deixe a mídia de montagem secar a 4 °C antes de adquirir imagens de epifluorescência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 Espessura lamínula de vidro (redondo 12 mm)	Ciências da Microscopia Eletrônica 7	72230-01
DMEM/F12	Tecnologias da Vida	11320-082
Meio Neurobasal	Tecnologias da Vida	Rolamento 21103
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4	Tecnologias da Vida	10010-023
Suplemento B27 (50X) Sem Soro	Tecnologias da Vida	Rolamento 17504-044	Conservadas sob a forma de alíquotas de 1 ml
L-Glutamina (200 mM)	Tecnologias da Vida	Rolamento 25030-081	Conservadas em alíquotas de 5 ml
Laminina de rato natural	Tecnologias da Vida	Rolamento 23017-015	Conservadas em alíquotas de 1 mg/ml
Prolongar o Antifade Mountant Gold	Tecnologias da Vida	Rolamento 47743-736	Conservadas em alíquotas de 10 mg/ml de 100 μl
Moxi Z Mini Contador de Células Automatizado	Orflo	MXZ001
Moxi Z Tipo S	Orflo	MXC002
Poli-D-Lisina	sigma	Pág. 7886	Ressuspensas em PBS 1X e armazenadas em alíquotas de 10 mg/ml 100 μl
Pipeta de 5 ml embalada individualmente (200/caixa)	Thermo Fisher Científico	1367811D
Pipeta de 10 ml embalada individualmente (200/caixa)	Thermo Fisher Científico	1367811E
Biolite tratado com cultura de tecidos 24 - placa de poços	Thermo Fisher Científico	130188
Cultura de tecidos tratada com biolite 6 - placa de poços	Thermo Fisher Científico	130184
Prato de 6 cm tratado com cultura de tecidos	Thermo Fisher Científico	130181
EMD Millipore Millex Seringa Estéril Filtro PVDF Tamanho dos poros: 0,22 μm	Thermo Fisher Científico	SLGV033RS
Pontas de pipeta de filtro TipOne 0,1 - 10 μl ponta de filtro alongada	EUA Científico	1120-3810
Ponteiras de pipeta de filtro TipOne 1 - 20 μl de ponta de filtro	EUA Científico	1120-1810
Pontas de pipeta de filtro TipOne 1 - 200 μl ponta de filtro	EUA Científico	1120-8810
Ponteiras de pipeta de filtro TipOne 101 - 1000 μl	EUA Científico	1126-7810
Tubos cônicos de 15 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)	EUA Científico	1475-0511
Tubos cônicos de 50 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)	EUA Científico	1500-1211