Cultura ex vivo e imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos

Resumo

Fonte: Whitman, M. C., et al. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture de camundongos embrionários que expressam GFP para imagens de lapso de tempo do crescimento do nervo oculomotor. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a cultura ex vivo e a imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos. Os embriões são isolados e incluídos em agarose. Usando um vibratome, são obtidas fatias contendo os núcleos oculomotores e os olhos. As fatias são mantidas em cultura e fotografadas usando um microscópio de fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos de modelo animal foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e o conselho de revisão veterinária JoVE revisou todos os procedimentos de modelo animal.

1. Acasalamentos cronometrados

1. Coloque ISL^MN:GFP (Proteína fluorescente verde do neurônio motor das ilhotas; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Nº de estoque: 017952) camundongos machos e fêmeas juntos durante a noite. Pese as fêmeas e registre os pesos antes do acasalamento.
   NOTA: ISL^MN: GFP rotula especificamente os neurônios m....

Resultados

Figura 1: Esquemático. E10.5 Embriões Isl^MN:GFP (A: foto, B: esquemático) são cortados em um vibratomo (400-450 μm de espessura) de modo que as seções incluam tanto o núcleo oculomotor quanto a órbita. Linhas tracejadas paralelas em A e B denotam a localização dos cortes do vibratomo. A linha tracejada inferior em A mostra onde a agarose deve ser aparada e cola.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Cultura de Tecidos de 24 Poços G	Genesee Científico	25-107
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	Genesee Científico	25-105
Pipeta Pasteur descartável (vidro de sílex)	VWR	14672-200
Fórceps Fino	Ferramentas de Belas Ciências	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Científico	A1896701
Glicose (200 g/L)	Thermo Fisher Científico	A2494001
Solução salina balanceada de Hank (1X)	Thermo Fisher Científico	14175-095
Soro bovino fetal inativado pelo calor	Biológicos de Atlanta	S11550H
Solução tampão HEPES (1M)	Thermo Fisher Científico	15630106
L-Glutamina (250 nM)	Thermo Fisher Científico	25030081
Supercola Loctite	Loctite
Baixo ponto de fusão Agarose	Thermo Fisher Científico	16520050
Inserto de cultura de células Millicell (30 mm, PTFE hidrofílico, 0,4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Colher Mini Perfurada Moria	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10370-19
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Científico	15140122
Placa de Petri (100 x 15mm)	Genesee Científico	32-107G
Solução salina tamponada com fosfato (1X, pH 7,4)	Thermo Fisher Científico	10010049
Lâminas	VWR	Rolamento 55411-050
Tesoura Cirúrgica - Blunt	Ferramentas de Belas Ciências	14000-12
Ti Eclipse Foco Perfeito com TIRF	Nikon
Vibratomo (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Lâminas Vibratome (Borda Dupla, Aço Inoxidável)	Ted Pella, Inc	121-6