Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de Instrumentos, Soluções e Meios
Nota: Todas as informações sobre materiais, reagentes, ferramentas e instrumentos relatados no protocolo são especificadas na Tabela de Materiais.
- Autoclave todos os instrumentos de dissecção e armazene-os em uma área estéril. Use os seguintes instrumentos: 4 pinças padrão (2 longas e 2 curtas) e 2 tesouras, além de 2 pinças (1 longa e 1 curta) e 1 tesoura para a dissecção; Mantenha um conjunto extra como backup.
- Prepare 100 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS)/soro fetal bovino (FBS) a 1% para usar durante lavagens, procedimentos de imunomarcação e etapas de classificação celular. Manter a solução refrigerada a 4 °C.
nota: Não adicione azida sódica (NaN3) à solução, pois pode ser tóxica para as células vivas.
- Prepare 100 mL de PBS / 1% FBS com 99 mL de PBS e 1 mL de FBS.
- Prepare 100 mL de meio de células neurais estéreis suplementado com 3% de FBS (ver Tabela de Materiais) para uso como meio de coleta e cultura. Manter o meio de cultura celular estéril a 4 °C. Aqueça-o apenas à temperatura ambiente (RT) antes de usar.
- Prepare 100 mL de meio de células neurais suplementado com 3% de FBS usando 97 mL de meio de células neurais e 3 mL de FBS.
- Tubos de coleta pré-resfriados (tubos de 15 mL) pré-revestidos com 5 mL de meio de coleta, colocando-os em um balde de gelo. Use apenas tubos de polipropileno para evitar que as células adiram à superfície do tubo.
- Coloque pratos de 40 mm, filtros de náilon de 70 μm, seringas, pilões para o filtro de células e tubos de polipropileno estéreis no gabinete de biossegurança. Esterilize todos os itens antes dos procedimentos e mantenha-os de forma estéril durante todo o procedimento.
nota: Todas as etapas após a coleta das retinas serão realizadas na cabine de biossegurança.
2. Preparação da Suspensão de Células da Retina
- Coloque o olho coletado na placa de base de um microscópio de dissecção para iniciar a dissecção da córnea. Disseque cada olho individualmente.
- Segure cuidadosamente o globo na base do nervo óptico usando uma pinça. Para esta etapa, use uma pinça padrão longa e uma curta.
- Use uma agulha afiada de calibre 30 (30G) para perfurar a córnea. Isso permitirá que o humor aquoso seja evacuado do olho, tornando mais fácil segurar o olho com a pinça.
- Segure a córnea com a pinça e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão na córnea. Descasque suavemente a córnea e a esclera usando a pinça. Quando o globo estiver descascado até a metade, role a retina e o cristalino usando a pinça. Descarte a córnea, a esclera e o cristalino.
nota: Este método garante que a retina se desprenda completamente do restante do olho.
- Coloque a retina em uma pequena placa de Petri de 40 mm contendo PBS/1% FBS.
nota: Como alternativa à placa de Petri, uma placa de cultura de células pode ser usada. Certifique-se de manter sempre as retinas úmidas, como em condições fisiológicas.
- Lave cada retina três vezes com PBS/1% FBS estéril fresco dentro do gabinete de biossegurança.
- Coloque até 12 retinas em um filtro de náilon estéril de 70 μm umedecido com PBS / 1% FBS. Usando a extremidade traseira de uma seringa de 10 mL, macere suavemente as retinas usando um movimento circular para separar as células.
- Alternativamente, use um pilão para a maceração do filtro celular ou use digestão enzimática com uma combinação de 15 UI / mL de papaína, 5 mM de L-cisteína e 200 U / mL de DNase I por 15 min a 37 ° C, seguido de inativação com PBS / 10% FBS.
nota: Nenhuma alteração na porcentagem de células recuperadas foi observada quando a digestão enzimática foi comparada à maceração com a extremidade traseira da seringa ou o pilão.
- Para transferir as células isoladas, coloque o filtro de nylon estéril de 70 μm sobre o tubo de coleta de polipropileno. Passe as células coletadas pelo filtro usando uma pipeta P1000. Enxágue o filtro (etapa 3.6) com PBS / 1% FBS para liberar as células restantes e transfira-as para o tubo de coleta.
- Adicione PBS/1% de FBS para obter um volume final de 1 mL por retina. Centrifugue a suspensão da célula por 7 min a 200 x g e RT.
Nota: Dependendo do número de retinas maceradas (< 6 retinas), o pellet celular pode ser muito pequeno para ser visível.
- Descarte o sobrenadante celular e ressuspenda o pellet celular em PBS / 1% FBS usando uma proporção de 1 mL por 5 retinas.
- Conte as células usando um hemocitômetro.
- Limpe um hemocitômetro de vidro e uma lamínula com álcool 70%. Gire suavemente o tubo que contém as células para garantir que a suspensão de células da retina seja distribuída uniformemente. Coloque 20 μL de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga e misture com 20 μL da suspensão celular.
- Misture suavemente e aplique 10 μL da mistura de suspensão de azul de tripano/célula a 0,4% no hemocitômetro, enchendo ambas as câmaras; a ação capilar atrairá a mistura de suspensão de azul/célula de 0,4% de azul de tripano sob a lamínula. Usando um microscópio, conte todas as células azuis negativas de tripano; Este número representa as células vivas.
- Determine a viabilidade celular usando a seguinte fórmula: contagem de células vivas / contagem total de células = % viabilidade.
nota: Se a viabilidade das células for inferior a 95%, um corante fluorescente é necessário para discriminar a viabilidade celular durante a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
- Use um corante de viabilidade fluorescente que não seja permeado a células vivas. Lave as células com PBS para remover qualquer vestígio de soro. Adicione 1 μL de corante fluorescente para discriminação de viabilidade celular por 5,0 x 106 células em um volume final de 100 μL. Incubar em RT por 15 min, protegido da luz. Adicione 10x o volume de PBS/1% FBS. Centrifugue por 5 min a 200 x g e RT.
- Se necessário, incubar a suspensão celular durante a noite a 4 °C. Se isso for feito, encha o tubo de suspensão celular com meio de células neurais em vez de PBS / 1% FBS. Colocar o tubo na horizontal e mantê-lo a 4 °C.
3. Imunomarcação das células da retina
- Use a seguinte conversão para determinar o volume de anticorpos por número de células: 2 μL de anticorpo por 5,0 x 106 células em um volume de 100 μL.
- Lave as células e mantenha-as em PBS/1% FBS. Pegue uma pequena alíquota de células (5,0 x 10,6 células) para usar como controle negativo (não rotulado) no momento da configuração da classificação.
nota: Esse controle negativo é fundamental para a calibração adequada do classificador de células.
- Para minimizar a ligação não específica de anticorpos às células que expressam os receptores Fcγ II e III, adicione 1 μL de um anticorpo anti-camundongo CD16 / 32 por 1,0 x 106 células em um volume final de 50 μL usando PBS / 1% FBS. Incubar por 10 min em RT.
- Adicione o coquetel de anticorpos à amostra e misture delicadamente por pipetagem. Incube por 30 min em um balde de gelo. Certifique-se de que o balde de gelo esteja coberto, pois a luz pode comprometer o experimento devido ao fotobranqueamento dos fluoróforos marcados.
- Prepare o coquetel de anticorpos usando os seguintes anticorpos anti-camundongo marcados com fluorescência: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (Ficoeritrina)-Cianina7, CD15 PE e CD57.
não marcados
Nota: Para cada anticorpo, use as seguintes concentrações por 5,0 x 106 células: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cianina7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; e CD57 não marcado, 0,4 μg.
- Use os volumes de acordo com os seguintes cálculos (com base nos anticorpos disponíveis comercialmente listados na Tabela de Materiais): total de 5,0 x 107 células a serem marcadas; 2 μL por 5,0 x 106 células = 20 μL de cada anticorpo; 4 anticorpos diferentes = 80 μL de coquetel de anticorpos; volume final = [(5,0 x 107 células totais)/5,0 x 106 células] x 100 = 1.000 μL; 80 μL de Abs + 50 μL de anti-mouse CD16/32 + 870 μL de PBS/1% de FBS = 1.000 μL.
nota: Essa combinação forneceu a combinação ideal de fluorocromos para a configuração do instrumento. Os seguintes parâmetros resumem a emissão e a excitação: AF-700, emissão de 719 nm quando excitada com um laser de diodo vermelho de 638 nm; PE-Cyanine7, emissão de 767 nm quando excitado com laser de diodo azul de 488 nm; e PE, emissão de 575 nm quando excitada com laser de diodo azul de 488 nm.
- Após a incubação de 30 minutos, aumente o volume para 5 mL usando PBS / 1% FBS. Lave as amostras centrifugando-as por 7 min a 200 x g e RT. Repita o procedimento uma vez para remover todos os anticorpos não ligados.
- Adicione 2 μL de anticorpo secundário (0,1 μg), que se ligará ao CD57 de 5,0 x 106 células. Incube por 30 minutos em um balde de gelo, como na etapa 3.4. Lave as células duas vezes, como na etapa 3.5.
- Rotule as células com um anticorpo secundário se um anticorpo primário não marcado tiver sido usado na etapa 3.4.
Nota: O anticorpo secundário de escolha para esta configuração está listado na Tabela de Materiais; Tem um comprimento de onda de emissão de 421 nm. Use-o com um filtro passa-banda de 450/50 nm quando excitado com o laser de diodo violeta a 405 nm.
- Use os volumes de acordo com os seguintes cálculos (com base no anticorpo comercialmente disponível listado na Tabela de Materiais): 2 μL por 5,0 x 106 células = 20 μL de anticorpo secundário; volume final = [(5,0 x 107 células totais)/5,0 x 106 células] x 50 = 500 μL; 20 μL de Abs + 480 μL PBS/1% FBS = 500 μL.
- Mantenha as células marcadas em PBS/1% FBS. Conte as células usando um hemocitômetro; usar uma concentração final de células da retina de 3,0 - 4,0 x 107 células/mL.
nota: Não use meio de cultura celular para diluir as células, pois o vermelho de fenol pode aumentar a autofluorescência, reduzindo assim a resolução entre células negativas e positivas. A concentração final da célula por volume depende muito da taxa de fluxo de volume da configuração do instrumento.
- Use controles de cor única durante a configuração para minimizar o transbordamento de fluorescência.
nota: Esta etapa, também conhecida como compensação, é aplicada para corrigir o ruído criado pela combinação de fluoróforos. Microesferas de poliestireno em PBS/0,1% BSA/2 mM NaN3 com a capacidade de se ligar a isotipos de imunoglobulina (Ig) marcados com fluorescência de várias espécies fornecem controles positivos para definir a compensação.
- Coloque 3 gotas das microesferas de poliestireno em tubos FACS estéreis, alocando uma por fluoróforo. Adicionar 1 μg do respectivo fluoróforo a cada tubo. Incubar durante 15 min em RT, protegido da luz. Adicione 3 mL de PBS/1% de FBS aos tubos de amostra. Centrifugue por 5 min a 200 x g e RT. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda em 250 μL de PBS / 1% FBS.
- Para configurar os controles negativos, use microesferas de poliestireno que não se liguem ao Ig. Se necessário, execute esta etapa no dia anterior.