Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
NOTA: Resumidamente, os fibroblastos foram reprogramados para iPSC por meio de reprogramação genética baseada em mRNA. As iPSCs foram mantidas em meio de células-tronco (SCM) (ver lista de materiais) e armazenadas a uma densidade de ~ 1,2 x 102 células / mL com 1 mL de SCM, 10 μM com inibidor de proteína quinase associado a rho (ROCKi) Y-27632 e 10% (v / v) de sulfeto de dimetila (DMSO), em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a -160 ° C. Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança, salvo indicação em contrário.
1. Diluição da matriz da membrana basal e revestimento da placa
- Diluído (1:50) fator de crescimento reduziu a matriz da membrana basal purificada do tumor Engelbreth-Holm-Swarm no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol.
- Revestir as placas de cultura de células com a quantidade apropriada de matriz de membrana basal diluída (ou seja, placa de 6 poços = 1 mL, placa de 12 poços = 0,5 mL) e incubar essas placas a 37 ° C por pelo menos 1 hora.
2. Manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)
NOTA: A confluência máxima por poço em uma placa de fundo plano de 6 poços é de ~1,2 x 106 células.
- Descongele as iPSCs criopreservadas em SCM com 10 μM de Y-27632 e coloque em uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal reduzida por fator de crescimento diluído.
- Mantenha iPSCs em SCM com 10 μM Y-27632 nas primeiras 24 horas após o descongelamento. Mude para meio fresco após 24 horas.
- Mantenha as iPSCs no SCM até que as células atinjam 80-90% de confluência antes de passar.
- Calcule quantas iPSCs serão necessárias para a diferenciação multiplicando a densidade desejada para diferenciação (15.600 células/cm2) pela área de superfície do poço. Para uma placa de fundo plano de 6 poços, multiplique 15.600 células/cm2 por 9,6cm2 para um total de 149.760 células/poço.
- Para a passagem, lave as células com a Solução Salina Balanceada de Hanks (HBBS). Em seguida, incubar as células com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) não enzimático (ver lista de materiais) durante 5 minutos a 37 °C.
- Use um raspador de células para levantar suavemente as células. Colete células em SCM fresco.
- Coloque as células em placas de cultura de células revestidas com SCM diluído e mantenha as células conforme descrito na etapa 2.3 ou armazene-as a ~ 1,2 x 106 células / mL em 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632 e 10% de DMSO (v / v) em frascos criopreservados em nitrogênio líquido à temperatura de -160 ° C.
3. Diferenciação de iPSCs para BMECs
NOTA: O EDTA não enzimático separa as células em aglomerados. O EDTA enzimático (ver Tabela de Materiais) separa as células em suspensão de célula única. O ácido retinóico (AR) deve ser protegido da luz.
- Lave os iPSCs uma vez com o tampão fosfato salino (DPBS) da Dulbecco. Incube com EDTA enzimático (1 mL para placa de 6 poços, 0,5 mL para placa de 12 poços e 0,25 mL para placa de 24 poços) por aproximadamente 5 minutos a 37 ° C para obter uma suspensão de célula única.
- Colete as células e centrifugue a 300 x g (força centrífuga relativa) por 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda os grânulos celulares em SCM contendo 10 μM de Y-27632.
- Determine a densidade celular usando Trypan Blue e contador de células automatizado ou um dispositivo hemocitômetro. Células da placa a uma densidade de 15.600 células/cm2 ou 149.760 células/poço de uma placa de fundo plano de 6 poços (com uma área de superfície de 9,6 cm2/poço) em SCM contendo 10 μM Y-27632 por 24 horas.
- Inicie a diferenciação após 24 horas, alterando o SCM para o meio E6. Troque o E6 médio diariamente pelos próximos 4 dias.
- No dia 4 de diferenciação, substitua o meio E6 por meio livre de soro endotelial humano (hESFM) suplementado com suplemento B27 diluído (1:200), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) de 20 ng/mL e 10 μM RA. Não altere este meio nas próximas 48 horas.
- Prepare 200 mL de hESFM com B27 diluído (1:200), misture 1 mL de suplemento concentrado de B27 50x para 199 mL de hESFM.
- Prepare 20 ng/mL de bFGF reconstituindo 50 μg de bFGF em 250 μL de tampão Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM de cloreto de sódio, NaCl) para fazer 200 μg/mL de solução-mãe. Prepare 200 mL de hESFM contendo 20 ng/mL de bFGF misturando 20 μL de 200 μg/mL de bFGF com 200 mL de hESFM.
- Prepare 10 μM de AR fazendo primeiro uma solução estoque de 40 mg / mL de AR, adicionando 2,5 mL de DMSO a 100 mg de pó de RA. Diluir esta concentração para 3 mg/ml para fazer uma solução de reserva a 10 mM. Prepare 200 mL de hESFM contendo 10 μM de AR misturando 200 μL de 10 μM de AR em 200 mL de hESFM.
4. Revestimento de matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para purificação de BMEC derivado de iPSC
- Adicione 2 mL de água estéril a 2 mg de FN para fazer 1 mg / mL de solução estoque de FN. Adicione 5 mL de água estéril a 5 mg de COL4 para fazer uma solução estoque de COL4 de 1 mg/mL.
- Deixar o FN dissolver-se durante, pelo menos, 30 minutos a 37 °C e dissolver o COL4 à temperatura ambiente.
- Diluir a solução-mãe de FN em água estéril até uma concentração final de 100 μg/ml e a solução-mãe de COL4 até uma concentração final de 400 μg/ml.
- Cubra as placas desejadas (placa de 6 poços = 1 mL de solução de COL4 / FN, placa de 12 poços = 0,5 mL, placa de 24 poços = 0,25 mL e placa filtrada de 12 transpoços = 0,25 mL) com a mistura de 400 μg / mL de COL4 e 100 μg / mL FN.
- Incubar as placas por um mínimo de 2 horas ou durante a noite a 37 ° C; para placas filtradas Transwell, recomenda-se um mínimo de 4 horas.
5. Subcultura e purificação de BMECs derivados de iPSC
NOTA: A incubação com EDTA enzimático pode levar mais de 15 minutos, dependendo da confluência das células no dia 6 de diferenciação.
- No dia 6 de diferenciação, lave as células duas vezes com DPBS. Incubar com 1 ml de EDTA enzimático durante pelo menos 15 minutos a 37 °C até obter uma suspensão unicelular.
- Colete as células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda os grânulos celulares com hESFM fresco com suplemento diluído (1:200) de B27, 20 ng/mL de bFGF e 10 μM de RA.
- Células-semente em placas revestidas com uma mistura de 400 μg/mL de COL4 e 100 μg/mL FN. Células-semente usando uma proporção de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa de 12 poços, 3 poços de uma placa filtrada de 12 transpoços ou 6 poços de uma placa de 24 poços.
