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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Configuração do material
- Incubar ovos de pintos em uma incubadora de ovos de mesa disponível comercialmente a 37 °C. Incubar ovos por 7 dias para embriões E7.
- Prepare matrizes de vários eletrodos (MEAs). Esterilize o número necessário de MEAs mergulhando-os em etanol a 70% por 3 a 4 h e depois enxaguando-os três vezes em aproximadamente 10 mL de água destilada estéril na coifa de nível de biossegurança II (BSLII).
nota: Os MEAs contêm 64 eletrodos de platina nanoporosos dispostos em uma grade de 8 x 8. O diâmetro do eletrodo é de 30 μm e o espaçamento entre os eletrodos é de 200 μm. Não use etanol desnaturado para esterilizar os MEAs, pois isso levará à corrosão.
- Coloque os MEAs dentro de um recipiente estéril com tampa (para manter as condições estéreis) e vá para uma incubadora de mesa. Asse por pelo menos 6 horas a 55 °C. Esta etapa é crítica para a esterilização adequada e a temperatura não deve exceder 60 °C. Para manter a esterilidade, mova o prato contendo MEAs para o exaustor BSLII para armazenamento até uso posterior.
nota: Usamos uma assadeira de vidro própria para forno com tampa de plástico e esterilizamos na superfície com etanol 70% e colocamos no exaustor BSLII para secar.
- Alíquota da solução de matriz extracelular (ECM). Descongelar o frasco para injetáveis a 4 °C durante a noite e congelar alíquotas de 100 μL a -20 °C.
nota: O ECM é enviado congelado. Não deve ser levado à temperatura ambiente até que esteja pronto para revestir, pois polimeriza à temperatura ambiente e é impossível revestir depois de polimerizado. A ECM sem fatores de crescimento é preferida para evitar efeitos adicionais devido a fatores desconhecidos.
- Esterilize todos os instrumentos de dissecção (pinça Dumont #5, pinça curva, tesoura pequena e tesoura de mola) e placas de dissecção revestidas com material autovedante com etanol a 70% e deixe-os secar na capela de dissecação.
2. Cultura de neurônios embrionários de pintinhos e atividade de rede
- No dia do revestimento, remova um frasco de ECM do freezer a -20 ° C, borrife com etanol a 70% e coloque-o no gelo. Diluir a 25% adicionando 300 μL de meio neurobasal frio dentro do capuz BSLII.
- Usando um pipetador P200, adicione 100 μL de ECM a 25% no centro do MEA, tomando cuidado para não tocar nos eletrodos e remova imediatamente, deixando uma película fina na superfície. Cubra o MEA e coloque na incubadora de CO2 (37 ° C e 5% de CO2) até que esteja pronto para colocar os neurônios na placa.
- Esterilize a casca externa de um ovo E7 (embrionário dia 7, incubado a 37 ° C por 7 dias) com etanol a 70%. Decapite o embrião em uma placa de dissecação do fundo Sylgard contendo solução de sais balanceados de Hank estéril a frio (HBSS) sem cálcio. Corte ao redor dos olhos e remova os globos oculares. Usando uma pinça fina DuMont # 5 e uma tesoura de mola, faça uma incisão no lado ventral e remova as camadas externas da pele para expor o prosencéfalo e o tecto óptico. Descasque e remova a membrana pial com cuidado. Transfira o prosencéfalo para outra placa de Petri e corte-o em pequenos pedaços de cerca de 2 mm com uma tesoura de mola.
nota: Não deve haver vasos sanguíneos ligados ao prosencéfalo após a remoção da membrana pial. Se disponível, é preferível realizar a dissecção em uma capela de dissecção estéril, embora tenhamos obtido resultados bastante bons quando a dissecção é realizada fora de uma capa, desde que os instrumentos e a área de dissecção sejam completamente esterilizados com etanol a 70%.
- Usando uma pipeta de transferência estéril, colete os pedaços de prosencéfalo em um tubo de centrífuga de 15 mL e remova o máximo possível do HBSS depois de deixá-los afundar no fundo do tubo de centrífuga.
- Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiamina tetracético (tripsina / EDTA) (pré-aquecido a 37 ° C) e incube a 37 ° C por 15 minutos.
- Usando uma pipeta Pasteur, remova cuidadosamente a tripsina sem perturbar os pedaços de tecido e adicione 1 mL de meio neurobasal. Deixe os pedaços de tecido afundarem e remova o meio. Repita esta lavagem mais uma vez. Esta etapa é para lavar a tripsina / EDTA.
- Adicione 2 mL de meio neurobasal e comece a triturar. A trituração envolve pegar uma pipeta Pasteur estéril polida a fogo e passar suavemente o tecido várias vezes até que não haja mais pedaços vistos. Se alguma peça permanecer após repetidas passagens, deixe-a assentar no fundo.
nota: Evite espumar durante a trituração - se a espuma se formar, pare e remova por aspiração.
- Dilua as células ressuspensas 1:10 com meio neurobasal e conte as células viáveis usando o corante Trypan Blue e um hemocitômetro. Misture 50 μL das células diluídas com 50 μL de solução de Trypan Blue em um tubo de centrífuga de 0,5 mL. Adicione 10 μL ao hemacitômetro após colocar a lamínula e conte as células claras brilhantes (as células azuis estão mortas e não devem ser contadas).
nota: Os números típicos de células de um único tectum óptico E7 variam entre 1 e 5 x 107 células/mL.
- Plaquear as células dissociadas em MEAs revestidos com ECM a uma densidade de 2.200 células/mm quadrados. Para o nosso sistema MEA, isso se traduz em aproximadamente 130.000 células por MEA. Adicione o meio neurobasal para trazer o volume no MEA para 1 mL e coloque MEAs na incubadora de CO2 durante a noite para fixação celular e extensão de neurite (Figura 1).
nota: Para MEAs de diferentes áreas e números de eletrodos, diferentes densidades celulares podem ser tentadas - em geral, uma densidade celular mais alta resulta em maior atividade de rede, mas também leva a culturas de vida mais curta.
