Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Resumo

A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

Resumo

Manipulação sistemática de um microambiente celular com resolução de micro e nanoescala é muitas vezes necessária para decifrar vários fenômenos celulares e moleculares. Para atender a esse requisito, temos desenvolvido uma técnica de litografia plasma para manipular o microambiente celular, criando uma superfície modelada com tamanhos recurso que variam de 100 nm para milímetros. O objetivo desta técnica é ser capaz de estudar, de forma controlada, o comportamento de células individuais, bem como grupos de células e suas interações.

Este método de litografia de plasma é baseado na modificação seletiva da química de superfície sobre um substrato por meio de proteger o contato de plasma de baixa temperatura com um molde físico. Esta blindagem seletiva deixa um padrão químico que pode guiá-adesão celular e movimento. Este padrão, ou modelo de superfície, pode então ser usado para criar redes de células cuja estrutura pode imitar aquela encontrada na natureza e produz um ambiente controlável para investigações experimentais. A técnica é bem adequado para estudar fenômeno biológico, uma vez que produz padrões de superfície estável em substratos poliméricos transparentes de forma biocompatíveis. Os padrões de superfície durar de semanas a meses e pode, assim, orientar a interação com as células por longos períodos o que facilita o estudo de longo prazo processos celulares, como diferenciação e adaptação. A modificação da superfície é principalmente de natureza química e, portanto, não apresenta interferência topográfica ou física para a interpretação dos resultados. Ele também não envolve quaisquer substâncias duras ou tóxicas para a alcançar padrões e é compatível para cultura de tecidos. Além disso, ele pode ser aplicado para modificar vários tipos de substratos poliméricos, que devido à capacidade de ajustar as suas propriedades são ideais para e são amplamente utilizados em aplicações biológicas. A resolução alcançável também é benéfico, como o isolamento dos processos específicos, tais como a migração, adesão ou ligação permite discretos, observações claro no único nível multicell.

Este método tem sido empregado para formar diversas redes de diferentes tipos de células para as investigações envolvendo a migração, sinalização, formação de tecido, eo comportamento e as interações de neurônios acusado em uma rede.

Protocolo

1. Criação de moldes usados ​​para modelar

1. Projeto conceitual de padrões. Padrões são criados que servem para formar redes de celular, entre em contato célula de controle, isolar as células, imitam estruturas naturais, ou guia de adesão celular e posicionamento.
2. Computer-aided design ou criação de CAD baseado em padrões e criação de fotomáscara. O padrão desejado é projetado em software CAD, como AutoCAD, e é então enviado para uma empresa de fora para produzir uma fotomáscara.
3. Fotolitografia para produzir modelo mestre. Lâminas de vidro são padronizados com qualquer um positivo fina resistir ou um negativo de espessura resistir dependendo do tamanho da estrutura que está sendo criado. Lâminas de vidro são usados ​​para os benefícios de ser de baixo custo, mais forte do que wafers de silício e não produzir poeira tanto quando quebrado. Alternativamente, outras estruturas convenientes, tais como redes de difração pode ser usado como o padrão de mestre.
4. O slide padrão está ligado a uma pilha de slides que não tenham sido estampados. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capela de fluxo limpo para minimizar a poeira.
5. Criação de moldes de mestre. Um recipiente de papel alumínio um pouco maior que a pilha de slides é criada para manter a 30 g de PDMS (polidimetilsiloxano) que é então derramado sobre a superfície photolithographically padronizada para criar um molde inicial. O PDMS é desgaseificados e permitiu a cura para 1-2 dias.
6. Uma vez curado, o PDMS é retirado do padrão de mestre e forma um molde para a próxima etapa.
7. 6 g de 2 epóxi parte (Devcon # 14310 (6 g) é misturado por 1 minuto e então derramada no molde mestre, desgaseificados e permitiu a cura. Desgaseificação o epóxi deve ser feito rapidamente (<8 min) usando bolha muitos quebrando ciclos e usando apenas uma fina camada antes que os conjuntos de epoxy e remoção de bolhas torna-se impossível remover as bolhas. O g 6 utilizado produz uma fina camada que facilita a remoção de bolhas rápido.
8. Após uma hora, o epóxi parte 2 será parcialmente curado e mais epóxi podem ser adicionados no topo sem desgaseificação para produzir uma estrutura que é mais grosso easer para lidar em etapas posteriores. O epoxy é, então, autorizado a cura para 1-2 dias.
9. Uma vez curado, o epóxi é removido do molde mestre PDMS e fita é enrolada em torno do molde de epóxi para formar um recipiente. Um molde de trabalho é então criada por vazamento PDMS no molde de epóxi, desgaseificação do PDMS, e cura de 1-2 dias.
10. Uma vez curado, o molde de trabalho é arrancado do epoxy e armazenados para manter a limpeza.

2. Padronização de superfícies com moldes para a orientação das células

1. Pequenas seções do molde de trabalho são cortadas e colocadas em uma placa de Petri de poliestireno. As localizações dessas seções do molde são rotulados.
2. Um tripé é formado a partir das seções pequenas e ponderado para garantir o contato entre o molde conformal de trabalho e a superfície da placa de Petri. Boa colocação pode ser observada olhando para o fundo do prato.
3. O conjunto é colocado dentro da câmara de plasma. Tratamento de plasma é iniciado e continuado a 150 Pa em 29,6 W (potência máxima) por 10 minutos, com ar plasma.
4. Após o tratamento de plasma, o molde e acusação de peso são removidos.
5. Placa de Petri é colocado sob luz UV por 10 minutos de esterilização dentro da cabine de segurança biológica e armazenado lá até semeadas com células.

3. Semeadura superfícies com células

1. Células SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma Humano ou outros são cultivadas utilizando protocolos padrão para o tipo de célula.
2. Confluência dos SH-SY5Y CRL-2266 células Neuroblastoma Humano é medido visualmente antes da semeadura sobre a superfície modelada.
3. Divisão celular normal é realizada para remover as células da superfície da sua placa de Petri.
4. As células, flutuando uma vez livre, são semeados sobre a superfície da placa de Petri padronizada depois de ser diluída para atingir a confluência desejada, quando colocado na superfície padronizada.
5. As células são autorizados a instalar e anexar à superfície.
6. O padrão de Petri é incubada por várias horas a vários dias enquanto as células para montar o padrão criado pelo plasma.
7. Quando a cultura de células do neuroblastoma, o ácido retinóico (10 mM) é adicionados diariamente a fim de induzir as células a se diferenciar em um estado neurônio-like. A adição do ácido retinóico é feito no escuro.
8. O ácido retinóico é adicionados diariamente por vários dias, após o que a diferenciação será observável.
9. Media é substituído a cada 3-4 dias.

4. Observação e Análise

1. Imagens periódica das células vivas ou vídeos são tomadas a fim de observar o comportamento das células ao longo do tempo. Para imagens ao vivo, as células são colocadas em uma incubadora microscópio estágio superior que mantém as células a 37 ° C, umidade de 100%, e 5% CO _2. As células podem também ser fixados e corados para observação sob fluorescência

5. Resultados representativos:

Um resultado típico da aplicação da técnica de litografia de plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a uma estrutura arbitrária ou natural. Isto é visto na Figura 1a-b onde as linhas e redes de neurônios foram criados. Outros tipos de células podem ser usadas, assim como visto na Figura 1c-d, o que mostra células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e C2C12 células do músculo esquelético formando grades. Materiais, tais como poli-l-lisina também pode ser modelado, Figura 1e para facilitar a fixação de certos tipos celulares e para outros usos. No caso dos neurônios mostrado, o que foi criado são redes de células que possuem conexões entre eles. Esta replica o que ocorre naturalmente no cérebro onde os neurônios têm ligações discretas entre células vizinhas que influencia o funcionamento do cérebro. Com a criação de uma estrutura deste tipo no laboratório, o número, posição, freqüência e outros fatores das ligações podem ser sistematicamente controlados. O resultado dessas arraignments pode ser medida visualmente e insumos adicionais, tais como produtos químicos ou estimulação elétrica pode ser implementada para investigar o comportamento da rede.

Um resultado negativo seria um padrão overgrown ou incompletos uma amostra contaminada. Um padrão incompleto ou overgrown resultaria de semeadura o substrato ou com células muito poucos ou muitos que não iria fornecer o padrão com uma quantidade ideal de células. Além disso, se o padrão não foi projetada corretamente (por exemplo, linhas muito estreito) as células não será capaz de unir e crescer com sucesso nele. No caso de uma amostra contaminada, limpeza adequada não teria sido mantida durante uma das etapas que isso é raro quando na sequência de protocolo de cultura celular adequada devido ao fato de que a padronização plasma também esteriliza o substrato.

Figura 1. Padronização de células e proteínas.

Discussão

O método de investigação de células aqui apresentada permite a criação de padrões complexos de redes multicelulares que imitam estruturas biológicas, bem como fornece um método para produzir estímulos que são subcelulares na natureza que, em seguida, facilita as investigações de ambos o comportamento das células agrupadas e respostas única célula a fatores ambientais. O uso deste método é simples, mas robusto, pois ele pode ser rapidamente realizados com equipamentos de baixo custo no mesmo laboratório como a cultura de células. É também fortemente células sensíveis, permite fácil observação do comportamento resultante e é por natureza estável por longos períodos de tempo, o que permite investigação do comportamento das células a longo prazo. Além disso, também permite uma gama diversificada de experimentos a serem realizados, uma vez que é compatível com muitos tipos de células e pode criar padrões arbitrários. A estabilidade a longo prazo da técnica deriva do fato de que a funcionalização da superfície transmitida pelo plasma é parte da superfície e não é um revestimento ou outra camada, que podem ser removidos ou degradados. Se mantida sob líquidos, este tipo de modificação pode manter a sua capacidade de orientação para celular meses.

A parte mais crítica da experiência necessárias para garantir resultados significativos é a de criar o modelo mestre que acabará por ser usado para a orientação das células. Se esse padrão não é adequadamente projetado, as células não respondem adequadamente ao padrão e não pode produzir um comportamento útil. Parâmetros como largura de linha, espaçamento padrão, e outros podem influenciar bastante a compatibilidade célula com um determinado padrão e, normalmente, uma série de parâmetros como pode ser criado no fotomáscara inicial para a tela para o projeto mais adequado.

Outros parâmetros importantes relacionados com a realização de padrões incluem a criação de moldes, manutenção de um ambiente livre de poeira, a semeadura de células e esterilidade geral de cultura de células. Criação de moldes pode ser efectuada pelas etapas de transferência de vários que são realizadas para permitir repetidas PDMS elenco fora de um molde de epóxi. O molde de epóxi é criada porque ela não irá degradar da mesma forma como resistir molde com pequenas estruturas de aspecto alta relação de fundição sob repetidos. Se a moldagem de transferência é feito corretamente, as dimensões eo rendimento não será afetado, mas se for feito de forma incorreta, como por mal de desgaseificação de cura, incompletas ou aquecimento excessivo, bolhas de aspereza, e deformação de um padrão pode ocorrer que afeta o resultado final. Em relação à manutenção de um ambiente livre de poeira, os moldes devem ser mantidas o mais limpo possível, pois a poeira pode interferir com o contato adequado entre o molde PDMS de trabalho e da superfície e, portanto, adequada blindagem plasma e padronização de produtos químicos. A densidade de semeadura das células também devem ser otimizados para garantir que nem as células muito poucos ou muitos habitam a área padrão e esterilidade deve ser mantida para evitar a contaminação bacteriana e outras das células sendo usado.

A técnica também pode ser incorporado com outros elementos, como a microfluídica, microeletrodos e sondas mecânicas. Isto proporciona estímulos adicionais para as células, a fim de melhor reproduzir várias condições fisiológicas durante a experimentação e os trabalhos futuros está focada em estudar os efeitos dessas combinações

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Plasma Cleaner e câmara de vácuo	Harrick Plasma	PDC-001
Fluorescência invertido e microscópio de contraste de fase	Nikon	TE2000-U
Microscópio estágio superior incubadora	AmScope	Modelo TCS-100	Modificado para incluir um gabinete que fornece uma atmosfera apropriada
Prato de Petri de poliestireno	VWR	25384-090
PDMS (polidimetilsiloxano)	Dow Corning	Sylgard 184
Epóxi	Devcon	2 epoxy ton clara # 14310
Cultura da mídia celular	Vários		Mídia segue formulações padrão para tipo de célula
Ácido retinóico	Sigma	R2625