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1. Geração de células progenitoras neurais derivadas de iPSC (iNPCs)
- Produza esferas EZ a partir de colônias iPSC conforme descrito abaixo e conforme publicado anteriormente.
- Cultive colônias de iPSC até a confluência em placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal (0,5 mg / placa) em mTESR1 ou outros meios comerciais (consulte a Tabela de Materiais).
- Remova o meio iPSC e substitua por 2 mL de meio EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 suplementado com 100 ng/mL de fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), 100 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 5 μg/mL de heparina e 2% de suplemento de B27].
- Raspe o fundo de cada poço confluente com a parte de trás de uma ponta de pipeta estéril de 1000 μL ou raspador de células.
- Recolher todas as células e colocá-las num balão T25 de fixação ultrabaixa para permitir a formação espontânea de esferas flutuantes. Incubar durante a noite a 37 °C.
- Alimente as esferas a cada 2-3 dias quando o meio ficar amarelo, substituindo metade do meio por ESM fresco. Isso permite que as esferas permaneçam em meio condicionado, o que é muito importante para seu crescimento e manutenção.
- Apoie o frasco em um suporte de tubo e deixe as esferas assentarem por gravidade por 1–2 minutos até o canto do frasco.
- Uma vez assentado, aspirar metade do sobrenadante com uma pipeta serológica de 5 ml ou 10 ml e substituí-lo por ESM fresco e pré-aquecido.
- Passagem de esferas EZ semanalmente cortando esferas com diâmetros de 200 μm, conforme descrito anteriormente. As esferas EZ podem ser mantidas por até 25 passagens e são ideais quando usadas entre as passagens 8–25.
- Prepare a suspensão unicelular de iNPCs:
- Para induzir a diferenciação neural, dissocie a esfera EZ em células únicas.
- Colete as esferas 3 a 4 dias após o corte de um frasco T75 e transfira-as para um cônico de 15 mL, depois deixe repousar por 2 min ou até que todas as esferas estejam assentadas no fundo.
- Remova lentamente o ESM com uma pipeta de 5 mL sem interromper as esferas estabelecidas. Adicione 1 ml de solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) e incube durante 10 min a 37 °C.
- Agite a solução de dissociação e as esferas após 5 minutos de incubação para garantir que todas as esferas sedimentadas sejam tratadas.
- Remova lentamente a solução de dissociação. Adicione 1 mL de meio de diferenciação neural [NDM; DMEM: F12 com 2% de B27 menos vitamina A, suplemento de 1% de N2 e fator neurotrófico derivado do cérebro humano (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturar as esferas em células únicas pipetando usando uma pipeta de 1 mL seguida por uma pipeta de 200 μL, até que todas as esferas tenham se dissociado. Evite a formação de bolhas durante o procedimento de trituração.
- Conte as células dissociadas usando um hemocitômetro e dilua as células até uma densidade final de 1 x 106 células / mL. É possível alterar a densidade dependendo da aplicação.
nota: Densidades mais altas (até 6 x 106 células/mL) são recomendadas para culturas de curto prazo de até 3 dias, e densidades mais baixas são recomendadas para aplicações de longo prazo de até 3 semanas.
nota: As células agora estão prontas para semear no canal superior do chip para formar o "lado do cérebro".
2. Diferenciação de iPSCs em iBMECs
- Passagem de iPSCs de um único poço confluente de uma placa de 6 poços na proporção de 1:6 para uma placa revestida com matriz de membrana basal de 6 poços. Deixe as células aderirem por 24 h. Troque o meio iPSC diariamente.
- Conte as células diariamente usando um hemocitômetro.
- Quando as células atingirem uma densidade de 1,5–3,0 x 105 células/poço, substitua o meio iPSC por 3 mL de meio não condicionado sem bFGF [DMEM: F12 1: 1, com reposição de soro knockout a 10% (KOSR), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), suplemento de glutamina a 0,5% (Tabela de Materiais) e 100 μM de β-mercaptoetanol]. Substitua o meio diariamente por 6 dias.
- No dia 6, substitua o meio por meio de células endoteliais (EC) [meio livre de soro endotelial humano (hESFM) suplementado com soro bovino derivado de plasma pobre em plaquetas a 1%, 20 ng/mL de bFGF e 10 μM de ácido trans-retinóico (RA)]. Deixe médio por 2 dias.
- Remova o meio EC e adicione 1 mL de solução de dissociação por poço. Incubar a 37 °C por 35 min.
nota: Embora isso seja considerado um longo tempo de incubação na solução de dissociação usada aqui, os iBMECs podem suportar esse tratamento com viabilidade celular superior a 90%.
- Separe as células do poço pipetando suavemente a suspensão celular e coletando todas as células em um tubo cônico de 15 mL.
nota: Evite pipetagem agressiva. Se as células não se desprenderem facilmente, incube por mais 5 min.
- Adicione 1 volume de meio EC ao cônico de 15 mL para inativar a Accutase, centrifugue a 200 x g por 5 min, remova o meio e substitua-o por 1 mL de meio EC (sem bFGF e RA).
- Conte as células usando um hemocitômetro e ajuste a densidade celular para 14–20 x 106 células/mL.
nota: As células agora estão prontas para serem semeadas no canal inferior do chip para formar o "lado do sangue".
3. Microfabricação do chip do órgão
- Use um chip de órgão para o modelo de chip BBB e sua produção como feito anteriormente. O chip de órgão de canal alto (ver Tabela de Materiais) é fabricado a partir de um elastômero de polidimetilsiloxano (PDMS) altamente flexível que contém dois canais de microescala sobrepostos e paralelos separados por uma membrana porosa flexível. Os tamanhos de microcanal superior e inferior são 1 mm x 1 mm e 1,0 mm x 0,2 mm, respectivamente. Os dois canais são separados por uma membrana porosa flexível de 50 μm de espessura feita com PDMS, contendo poros de 7 μm de diâmetro com espaçamento de 40 μm. A área de superfície da membrana porosa que separa os canais é de 0,171 cm2.
4. Preparação de chips
- Os chips de órgão são fornecidos pré-embalados dentro do suporte do chip, eliminando a necessidade de perturbar ou distorcer o alinhamento do chip durante o manuseio. Além disso, o portador do chip se conecta com segurança a um módulo portátil ("Pod") que atua como interface entre o módulo de cultura e o chip.
- Pulverize a embalagem dos chips com etanol 70% e leve-os para o gabinete de biossegurança (BSC).
- Abra a embalagem e coloque o chip do órgão em uma placa de Petri estéril. Manuseie o porta-cavacos apenas pelos lados para evitar o contato direto com o cavaco.
- Certifique-se de que a guia da portadora esteja voltada para a direita (Figura 1) e, ao usar vários chips, alinhe-os todos na mesma orientação.
- Rotule cada chip na guia do transportador (a preparação completa do chip e o fluxo de trabalho são mostrados na Figura 2).
5. Ativação de superfície e revestimento ECM
- Preparação da solução de ativação de superfície
- O reagente emulado 1 (ER-1), fornecido em um frasco contendo 5 mg, é sensível à luz. Prepare uma nova solução ER-1 imediatamente antes de usar. A integridade do ER-1 é crucial na preparação bem-sucedida dos chips.
- Desligue a luz no BSC ao manusear ER-1.
nota: O ER-1 é um irritante ocular e deve ser manuseado no BSC com luvas e proteção oculares adequadas.
- Deixe os reagentes ER-1 e ER-2 se equilibrarem à temperatura ambiente (RT) antes de usar.
- Proteja a solução da luz envolvendo um tubo cônico estéril vazio de 15 mL com papel alumínio.
- No BSC, bata brevemente no frasco ER-1 para assentar o pó no fundo.
- Adicione 1 mL de tampão ER-2 ao frasco e transfira imediatamente seu conteúdo para o fundo do tubo cônico envolto em 15 mL. Não pipete para misturar. A cor da solução transferida para o tubo cônico será vermelha.
- Repita a etapa 5.1.6 3x. Na última rodada, tampe o frasco ER-1 e inverta para coletar o pó restante da tampa e, em seguida, transfira a solução para o tubo cônico; isso elevará o volume total para 4 mL de solução ER-1.
- Adicione 6 mL de solução de ER-2 aos 4 mL de solução de ER-1 no tubo cônico de 15 mL até uma concentração final de 0,5 mg / mL. O ER-1 deve ser totalmente dissolvido na solução de ER-2.
- Ativação de superfície
- Utilizando uma pipeta P200 e uma ponta de pipeta filtrada estéril de 200 μL, pegue 200 μL da mistura ER-1.
- Coloque a pipeta na entrada inferior e empurre 20 μL de mistura ER-1 através do canal inferior até que a mistura comece a fluir para fora da saída do canal inferior.
- Adicione aproximadamente 50 μL de mistura ER-1 e coloque-a na entrada do canal superior. Empurre a mistura pelo canal superior até que comece a fluir para fora da saída do canal superior.
- Remova todo o excesso de mistura ER-1 da superfície do chip por aspiração suave. Certifique-se de que a mistura ER-1 seja removida apenas da superfície do cavaco e não dos canais.
- Verifique se os canais estão livres de bolhas de ar antes da ativação ultravioleta (UV). Se forem detectadas bolhas de ar, remova as bolhas lavando o canal com a mistura ER-1.
- Coloque o prato aberto contendo as batatas fritas na caixa de luz UV (fornecida pela Emulate Inc.).
- Defina o interruptor na parte de trás da caixa de luz UV para a configuração "Consistente". Ligue a energia e inicie a ativação UV. Deixe os chips sob luz ultravioleta por 20 min.
nota: Evite a exposição do pessoal à luz ultravioleta.
- Remova a mistura ER-1 de ambos os canais.
- Lave cada canal com 200 μL de solução ER-2.
- Remova o ER-2 de ambos os canais.
- Lave cada canal com 200 μL de solução salina estéril e fria tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
- Deixe o DPBS frio dentro dos canais até prosseguir para a próxima etapa.
- Preparação e revestimento de matriz extracelular (ECM)
- Prepare a solução de ECM combinando os componentes individuais do ECM com DPBS frio, água ou outro solvente para as concentrações finais de trabalho. A solução de ECM deve ser preparada fresca cada vez que for usada.
- Cubra os canais superior e inferior do chip com ECM, com composição determinada pelo tipo de célula a ser semeada. A mistura de ECM deve ser mantida em gelo até o uso.
- Use laminina (50 μg/ml) para revestir o "lado do cérebro" e colagénio IV e fibronectina misturados numa proporção de 4:1 (320:80 μg/ml) para revestir o "lado do sangue" conforme descrito na secção 5.6.
- Preparação de alíquotas de ECM
- Diluir 1 mg/ml de laminina em DPBS fria até uma concentração final de 50 μg/ml. Alíquota e conservar a -20 °C até à utilização.
- Dissolva o colágeno IV em ácido acético a 0,1% até uma concentração de 1 mg / mL. Incubar a solução a 2–8 °C durante a noite ou a RT durante 1-3 h ou até dissolver totalmente.
- Prepare uma mistura de 1 mL de colágeno IV: fibronectina (320 μL de colágeno IV, 80 μL de fibronectina, 600 μL de H2O duplo destilado estéril). A mistura pode ser armazenada a -20 °C.
- Revestindo os chips com ECM
- Aspire totalmente o DPBS frio de ambos os canais. Defina uma pipeta P200 para absorver 100 μL de solução de colágeno IV: fibronectina.
- Introduza a solução através da entrada do canal inferior até que uma pequena gota se forme na saída. Deixe uma pequena gota na entrada após remover a ponta da pipeta.
- Introduza a solução de laminina através da entrada do canal superior até que uma pequena gota se forme na saída. Deixe uma pequena gota na entrada após remover a ponta da pipeta.
- Observe atentamente os canais para garantir que não haja bolhas. Se houver bolhas, lave o canal com a solução ECM apropriada até que todas as bolhas sejam removidas.
- Repita as etapas 5.5.1 a 5.5.4 para cada chip.
- Adicione 1,5 mL de DPBS à tampa de um tubo cônico de 15 mL. Coloque a tampa DPBS na placa de cultura de 150 mm com as lascas para fornecer humidade extra e feche a placa com parafilme. Para obter melhores resultados, incube os cavacos a 4 °C durante a noite.
nota: Se desejado, as células podem ser semeadas no mesmo dia da ativação do chip e do revestimento ECM, embora a incubação noturna seja preferida. Os cavacos podem estar prontos para semeadura 4 h após a adição do ECM e incubação dos cavacos a 37 °C.
6. Semeando o canal do "lado do cérebro" e diferenciando esferas EZ em culturas neurais mistas
- Traga o prato contendo as batatas fritas preparadas para o BSC. Lave suavemente ambos os canais com 200 μL de NDM.
- Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente o excesso de gotículas de mídia da superfície do chip. Agite suavemente a suspensão celular antes de semear cada chip para garantir uma suspensão celular homogênea
- Semeando os iNPCs no canal superior para gerar o "lado do cérebro"
- Semeie as células (1 x 106 células/mL) no canal superior do chip. Adicione uma ponteira P200 contendo 30–100 μL de suspensão celular à entrada do canal superior e solte suavemente a ponteira da pipeta. Pegue uma pipeta P200 vazia, pressione o êmbolo, insira-o na saída do canal superior e puxe cuidadosamente a suspensão de célula única através do chip.
- Cubra o prato e transfira para o microscópio para verificar a densidade de semeadura e a distribuição homogênea das células dentro do canal superior. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta das portas de entrada e saída de cavacos.
- A densidade de semeadura deve aparecer como 20% de cobertura. Se a densidade de semeadura for maior ou menor do que o esperado ou irregular, retorne os cavacos ao BSC, lave o canal 2x com 200 μL de meio fresco e repita a etapa 6.3.1.
- Depois de confirmar a densidade celular correta, coloque imediatamente os cavacos na incubadora por 2 h a 37 °C após a semeadura de cada lote de cavacos. Lave as células que não se ligam com NDM fresco.
- Manter as células em condições estáticas a 37 °C com uma reposição diária de NDM durante pelo menos 48 h antes de iniciar o fluxo. Os iBMECs podem ser semeados após a fixação dos iNPCs ou num dia subsequente após a propagação do iNPC.
7. Semeando iBMECs no canal inferior para gerar o "lado do sangue"
- Traga o prato contendo as batatas fritas preparadas para o BSC. Lave suavemente o canal inferior com 200 μL de meio EC.
- Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente as gotículas do excesso de meio EC da superfície do chip, certificando-se de deixar o meio em ambos os canais. Agite suavemente a suspensão celular antes de semear cada chip para garantir uma suspensão celular homogênea.
- Usando uma pipeta P200, retire 30 a 100 μL da suspensão de células iBMEC (14 a 20 x 106 células / mL) e coloque a ponta na entrada do canal inferior. Desconecte cuidadosamente a ponteira da pipeta, deixando a ponteira contendo células na porta de entrada.
- Pressione o êmbolo em uma pipeta P200 com a ponta vazia, insira na saída do canal inferior e puxe cuidadosamente a suspensão de célula única pelo canal inferior, soltando lentamente o êmbolo da pipeta.
- Aspire o excesso de suspensão celular da superfície do chip. Evite o contato direto com as portas de entrada e saída para garantir que nenhuma suspensão de célula seja aspirada para fora dos canais.
- Cubra o chip e transfira-o para o microscópio para observar a densidade de semeadura. O canal inferior deve ser preenchido sem lacunas observáveis entre as células quando observado em 4x ou 10x ao microscópio (Figura 3).
- Se a densidade de semeadura estiver abaixo de 90% de cobertura ou estiver distribuída de forma desigual, ajuste a densidade celular de acordo e repita as etapas 7.2 a 7.6 até que a densidade correta seja alcançada dentro do canal. Depois de confirmar a densidade celular correta (Figura 3), semeie as células nos chips restantes. Para anexar células à membrana porosa, localizada na parte superior do canal inferior, inverta cada chip e descanse em um berço de chip.
- Coloque um pequeno reservatório (tampa de tubo cônico de 15 mL contendo DPBS estéril) dentro do prato de 150 mm para fornecer umidade para as células. Incubar as pastilhas a 37 °C durante cerca de 3 h ou até que as células do canal inferior se tenham fixado. Uma vez que os iBMECs tenham se conectado (~ 3 h após a semeadura), vire os chips de volta para a posição vertical para permitir a fixação da célula na parte inferior do canal inferior.
8. Início do fluxo
- O fluxo é normalmente iniciado 48 h após a semeadura de iBMECs. Este tempo é necessário para que os iBMECs se prendam firmemente ao chip.
- Para manter o fluxo laminar através do chip, é importante desgaseificar e equilibrar a temperatura do meio. O meio deve ser pré-aquecido em banho-maria a 37 °C durante 1 h.
- Até 50 mL de meio aquecido podem ser desgaseificados por incubação sob um sistema de filtragem acionado a vácuo por 15 min.
- Preparação de módulos portáteis
- Higienize o exterior da embalagem e das bandejas do módulo portátil com etanol a 70%, limpe e transfira para o BSC. Abra a embalagem e coloque os módulos na bandeja. Oriente-os com os reservatórios na parte de trás da bandeja.
- Pipete 3 mL de meio quente pré-equilibrado para cada reservatório de entrada. Adicione o meio de cultura EC ao reservatório de entrada do canal inferior e o NDM ao reservatório de entrada do canal superior do canal superior (Figura 4).
- Pipete 300 μL de meio quente pré-equilibrado para cada reservatório de saída, diretamente sobre cada porta de saída (Figura 4).
- Coloque até seis módulos portáteis em cada bandeja. Traga as bandejas para a incubadora e deslize-as completamente para dentro do módulo de cultura com a alça da bandeja voltada para fora.
- Selecione e execute o ciclo "Prime" no módulo de cultura. Feche a porta da incubadora e deixe o módulo de cultura preparar os módulos portáteis (leva ~ 1 min). O ciclo de escorva é concluído quando a barra de status exibe "Pronto". Remova a bandeja do módulo de cultura e leve-a ao BSC.
- Verifique se os módulos portáteis foram preparados com sucesso inspecionando a parte inferior de cada módulo portátil no BSC. Procure a presença de pequenas gotículas em todas as quatro portas.
- Se algum módulo portátil não mostrar gotículas, execute novamente o ciclo principal nesses módulos. Se algum meio pingar na bandeja (isso pode ocorrer com mais frequência pelas portas de saída), limpe a bandeja com etanol a 70%.
- Conexão de chips a módulos portáteis, regulagem e início de fluxo
- Lave suavemente os dois canais de cada chip com meio de cultura específico para células quente e equilibrada para remover quaisquer bolhas possíveis no canal e coloque pequenas gotículas de meio (de acordo com o meio no canal) na parte superior de cada porta de entrada e saída.
- Insira chips com transportadores nos módulos portáteis e coloque até seis em cada bandeja. Insira as bandejas no módulo de cultura. Programe as condições apropriadas de cultura de chips de órgãos (taxa de fluxo e estiramento) no módulo de cultura.
- As condições programadas serão iniciadas assim que o ciclo "Regular" for concluído.
nota: As taxas de fluxo para cada canal podem ser controladas independentemente e podem ser definidas para taxas que variam de 0 a 1.000 μL/h. O chip BBB é normalmente cultivado a 30 μL/h. Ao fluir meios como meios EC ou ESM a 30 μL/h e 1000 μL/h, as forças de cisalhamento são 0,01 din/cm2 e 0,33 din/cm2, respectivamente.
- Execute o ciclo "Regular", que leva aproximadamente 2 h, após o qual o módulo de cultura começará a fluir nas condições predefinidas de cultura de chips de órgãos.
