Geração de fatias do córtex cingulado anterior do tálamo medial a partir de cérebros de camundongos

Resumo

Fonte: Lu, H., et al. Estimulação por corrente contínua e gravação de matriz de múltiplos eletrodos da atividade semelhante a convulsões na preparação de fatias cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra a preparação de fatias do córtex cingulado anterior do tálamo medial (MT-ACC) a partir de cérebros de camundongos. O cérebro de um camundongo é dissecado, cortes são feitos para expor a via MT-ACC e fatias são geradas usando um vibratome. As fatias de MT-ACC são então mantidas em líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação da fatia do cérebro

1. Use camundongos C57BL / 6J machos, 4-8 semanas de idade. Alojar os animais em uma sala com ar condicionado (21-23 °C; 50% de umidade; ciclo claro/escuro de 12 horas/12 horas, luzes acesas às 8:00 da manhã) com acesso gratuito a comida e água.
2. Pegue uma alíquota de 250 ml do líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) e coloque-a em um copo que contenha gelo. Ao mesmo tempo, forneça gás contínuo composto por 95% de O₂ e 5% de CO₂.
3. cirurgia
   1. Anestesiar o animal com isoflurano a 4% em uma caixa de vidro por aproximadamente 3 min. Quando o animal atingir uma profundidade cirúrgica de anestesia (indicada pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé), coloque-o em uma bandeja rasa cheia de gelo picado e remova a cabeça usando uma tesoura.
   2. Exponha o crânio e corte o músculo restante. Em seguida, usando rongeurs, retire a superfície dorsal do crânio do cérebro. Apare os lados do crânio usando rongeurs. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com uma solução de etanol a 75%.
   3. Usando uma espátula, corte os bulbos olfatórios e as conexões nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro e remova o cérebro. Após a decapitação, transfira rapidamente o cérebro para um béquer cheio de aCSF oxigenado gelado.
4. Preparação de Fatia de Cérebro do Tálamo Medial (MT)-Córtex Cingulado Anterior (ACC)
   nota: Prepare fatias que contenham o caminho do MT para o ACC.
   1. Corte manualmente o bloco cerebral com dois cortes sagitais 2,0 mm laterais à linha média em cada hemisfério para exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça dois cortes angulares. Faça o primeiro corte transversal paralelo ao trato de fibras visíveis no estriado.
   2. Faça o segundo corte transversal da conexão entre o cerebelo e o córtex visual até o ponto médio entre a comissura anterior e o trato óptico que são ventrais e paralelos à via do talamocingulado.
   3. Prenda o bloco cerebral a uma placa angular (~ 120 °) com adesivo de cianoacrilato e faça um corte logo acima do ponto de virada do caminho. Desdobre a placa, alise-a e cole-a no estágio da câmara de um vibratome.
   4. Faça fatias de cérebro de tálamo-ACC medial (500 μm de espessura) e, em seguida, mergulhe-as em aCSF oxigenado gelado. Transferir as fatias para a câmara de registo e manter a 32 °C sob perfusão contínua (12 ml/min) com aCSF oxigenado durante 1 hora.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anestésico:
Isoflurano	Corporação de Produtos Halocarbon	NDC 12164-002-25	4% de sucesso
aCSF (total: 1L):
D(+)-glicose	Merck	Rolamento 1.08337.1000	10 mM
Hidrogenocarbonato de sódio	Merck	Rolamento 1.06329.0500	25 mM
cloreto de sódio	Merck	Rolamento 1.06404.1000	124 mM
(+) -L-ascorbato de sódio, > = 98%	sigma	A4034-100G	0,15 g / 2 c.c
Sulfato de magnésio anidro ReagentPlus	sigma	M7506-500G	2 mM
Cloreto de cálcio di-hidratado	Merck	Rolamento 1.02382.1000	2 mM
Di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado	Merck	1.06346.1000	1 mM
Cloreto de potássio	May & Baker Ltd Dagenham Inglaterra	EM 7616	4,4 mM