Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Microdissecção do telencéfalo dorsolateral
- Prepare o meio de dissecção (100 mL): 98,5 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL).
- Filtre e esterilize o meio de dissecação.
- Remover embriões embrionários do dia 14 (E14) de um camundongo C57/Bl6 (Mus musculus) prenhe sob anestesia com isoflurano.
nota: Considere E0 como o dia da detecção do tampão vaginal. A dissecção deve ser concluída o mais tardar 1 h após a remoção do camundongo prenhe. Este protocolo também se aplica aos embriões E11-E17.
- Remova os embriões por histerectomia em condições estéreis.
- Transferir os embriões para uma placa de Petri com um meio de dissecação a frio (4 °C).
- Remova os cérebros do crânio cortando ao longo da fissura longitudinal. O número de embriões geralmente varia de cinco a dez. Cada cérebro E14 produz aproximadamente 2 x 106 células, incluindo progenitores e neurônios pós-mitóticos (proporção de 1:1)
nota: Use o estereomicroscópio para as etapas a seguir.
- Remova as meninges usando uma pinça de dissecção. Divida o telencéfalo ao meio para separar os hemisférios. Para isolar o telencéfalo dorsolateral, corte ao longo da curva dorsomedial e do limite palial-subpalial usando uma pinça de dissecção. Transfira o telencéfalo dorsolateral para um tubo de 2 mL com um meio de dissecção a frio (4 ° C) até que todos os cérebros sejam dissecados.
2. Dissociação e Plaqueamento Celular
- Prepare o meio de proliferação (50 mL de DMEM + 10% FCS): 44 mL de meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM), 5 mL de soro fetal de bezerro (FCS), 0,5 mL de glicose a 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL). Filtre-esterilize o meio de proliferação.
- Prepare meio de diferenciação (50 mL de DMEM + 2% B27): 48 mL de DMEM, 1 mL de B27, 0,5 mL de glicose a 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL). Filtre-esterilize o meio de diferenciação.
- Após a microdissecção do telencéfalo dorsolateral de camundongos E14, centrifugue o tubo com o tecido coletado e o meio de dissecção a frio (por 5 min a 4 ° C, 340 x g) para precipitar o tecido.
- Remova o sobrenadante com uma pipeta e adicione 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) pré-aquecido (37 ° C) (0,05%) para digestão química. Incubar durante 15 min a 37 °C. Adicionar 2 ml de meio de proliferação para parar a atividade da tripsina.
- Polir a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro sobre um queimador de gás ou bico de Bunsen por alguns segundos para diminuir ligeiramente a abertura. Lave a pipeta aspirando FCS para revestir a ponta. Para evitar bolhas, dissocie as células mecanicamente com uma pipeta Pasteur polida a fogo e revestida com FCS.
- Centrifugue as células (durante 5 min a 4 °C, 340 x g). Remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicione 1 mL de meio de proliferação e ressuspenda as células usando uma pipeta. Repita esta etapa uma vez.
- Prepare uma diluição de 1:1 da suspensão celular usando uma solução de azul de tripano a 0,4%. As células não viáveis serão azuis. Usando uma câmara de Neubauer, conte o número de células viáveis (não coradas).
- Dilua as células em um meio de proliferação para obter 106 células / mL. Adicionar 500 μL da suspensão celular a cada alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (aproximadamente 2,5 × 105 células/cm2). Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2,
nota: Não use lamínulas de vidro, pois elas podem se mover durante o experimento e alterar o campo de observação. Como alternativa, use placas de cultura de tecidos com fundo de vidro.
nota: Se você não estiver usando multiplacas tratadas com cultura de células, é importante pré-tratar suas placas com Poli-D-lisina (50 μg/ml) por 2 h a 37 °C. As placas tratadas com PDL podem ser armazenadas a 4 °C após lavagem com água destilada.
