Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Colete DRG lombar de ratos experimentais
- Use ratos Sprague-Dawley (SD) de 2 a 3 semanas de idade para coleta lombar de DRG.
NOTA: Os neurônios DRG coletados de ratos com mais de 4 semanas de idade não crescem bem nas condições de cultura aqui descritas.
- Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave.
- Anestesiar o rato com uma mistura 1:1 de tiletamina e zolazepam (20 mg/kg; injeção intraperitoneal (IP)) e esperar até que o animal não apresente resposta de retirada do pé em um teste de pinça do dedo do pé.
nota: Diferentes estratégias de anestesia podem ser usadas com sucesso neste protocolo.
- Sacrifique o rato por decapitação com uma guilhotina comercial.
- Use a guilhotina para isolar o tronco do corpo do rato entre o membro anterior e o fêmur. Veja a Figura 1A para um diagrama da região a ser coletada.
nota: A linha de corte caudal deve ser apenas rostral ao fêmur. O DRG L6 lombar será excisado se o local do corte for muito alto na coluna vertebral.
- Corte ao longo do esterno e remova todos os órgãos/tecidos com tesoura de dissecção (Figura 2A-a).
- Corte ao longo da lateral do tronco para coletar a parte dorsal do rato e remover a pele. Veja a Figura 1B para uma fotografia do tronco dorsal dissecado.
- Prepare o tecido no gelo antes de coletar o DRG. Limpe o pelo e o sangue das luvas e esterilize-os com etanol a 75% antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Remova os músculos que cobrem a coluna lombar. Primeiro, faça dois cortes ao longo dos lados da coluna vertebral (esquerda e direita) e um corte lateral para marcar a extensão rostral da coluna lombar. Em seguida, remova os músculos dorsais da coluna vertebral com pinça de corte ósseo (Figura 2A-b).
- Remova a porção dorsal das vértebras com uma pinça de corte ósseo e exponha a medula espinhal.
- Remova a medula espinhal com tesoura de dissecção (Figura 2A-c) e fórceps (Figura 2A-d).
- Identifique o DRG lombar contando as vértebras da última costela (Vértebra Torácica 13). Veja a Figura 1C para um diagrama das posições das vértebras.
- Colete o DRG lombar bilateral (L1-L6) com microtesoura (Figura 2A-f) em uma placa de cultura de 35 mm com 2 mL de meio sem soro gelado. Remova as fibras neuronais (conforme indicado na Figura 1C) do DRG de conexão e, em seguida, transfira-as para a placa de cultura para melhorar a pureza das culturas.
nota: O DRG coletado pode ser mantido em meio no gelo por cerca de 1 h. Enquanto isso, vários ratos podem ser sacrificados para criar um pool maior de DRG.
2. Cultura primária do DRG de madeira de rato
NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em uma capela de fluxo laminar.
- Prepare meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, 100 mM de piruvato de sódio e 1x penicilina/estreptomicina em 1x DMEM-F12.
- Cubra a placa de 24 poços tratada com cultura de células com 200 μg / mL de poli-L-lisina por 2 h e depois lave com água esterilizada.
- Pré-incubar a placa de cultura com 1 ml de meio de cultura numa incubadora de CO37 °C 2 antes de utilizar durante pelo menos 30 min.
- Transferir o prato de 35 mm contendo DRG para uma capela laminar e lavar o DRG com meio sem soro 3 vezes com pipeta.
nota: A parte externa do prato deve ser limpa com etanol a 75% antes de transferir para o exaustor. O prato de 35 mm pode conter DRG de vários ratos (isso dependerá das demandas do projeto experimental).
- Mover o DRG (de um único rato ou combinado de vários ratos) para uma nova placa de cultura de 35 mm, que contenha 2 mL de colagenase tipo IA (1 mg/mL em meio sem soro) com pinça estéril (Figura 2A-e).
nota: A solução de colagenase deve ser esterilizada passando-a por um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Digerir o DRG na solução de colagenase numa incubadora de CO37 °C 2 durante 30 min.
- Retirar a solução de colagenase e lavar o DRG 3 vezes em 2 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS).
nota: Pode haver fibras residuais ou tecidos que saem do DRG para a solução. Remova-os com pipeta com a solução de lavagem.
- Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido no prato contendo DRG de 35 mm e digerir o DRG em uma incubadora de CO37 ° C 2 por 30 min.
- Transferir os 2 mL de solução contendo DRG para um tubo de centrífuga de 15 mL por pipeta de vidro.
nota: O DRG pode grudar na pipeta de vidro, portanto, esta etapa deve ser realizada com cuidado. A perda de DRG pode ser evitada mantendo a solução contendo DRG na extremidade cônica de uma pipeta de vidro (cerca de 0,5 mL) e transferindo a solução para o tubo de centrífuga lentamente, mas sem pausa.
- Centrifugue a solução a 290 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e adicione outro meio isento de soro de 2 ml para ressuspender o DRG.
- Repita a etapa 2.10 2 vezes, mas troque o meio sem soro para meio de cultura pré-aquecido na última vez.
- Triturar manualmente o DRG aproximadamente 60 vezes usando uma pipeta Pasteur polida por chama (comprimento de 230 mm e diâmetro interno da cabeça da ponta de 1 mm). Veja a Figura 2B para obter uma fotografia comparando o orifício de uma pipeta Pasteur polida com uma pipeta não polida.
nota: O diâmetro interno da pipeta Pasteur polida por chama é aproximadamente 10% menor do que a pipeta de controle e o interior da extremidade cônica deve ser mais liso. Tenha cuidado para não criar bolhas ao triturar as células.
- Remova o prato revestido de poli-L-lisina da incubadora de CO2. Aspirar o meio de cultura incubado da placa e semear as células dissociadas na placa revestida.
- Semeie as células DRG de um rato (coleta bilateral de L1-L6, para 12 DRG totais) em quatro poços de uma placa de 24 poços; há aproximadamente 5 x 104 células em um poço de uma placa de 24 poços.
nota: Esta densidade é adequada para imunocoloração. Para extração de Western blot ou RNA, semeie as células DRG de um rato (L1-L6 bilateral) em um poço de uma placa de 6 poços.
- Substitua o meio de cultura no dia seguinte pela adição de 10 μM de citarabina (Ara-C) e 100 ng/mL de NGF e atualize o meio a cada dois dias a partir de então.
nota: O DRG torácico também pode ser cultivado por este protocolo, se tiver sido coletado da coluna torácica.
