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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
NOTA: As soluções de cultura de células devem ser preparadas usando procedimentos estéreis em uma cabine de segurança biológica e filtradas a 0.2 μm para evitar contaminação.
1. Preparação de soluções e meio de cultura
- Prepare a solução de revestimento de laminina diluindo 20 μL de estoque de laminina de 1 mg / mL em 2 mL de H2O destilado estéril. Prepare no dia da dissecação.
- Prepare a solução de parada de soro (ES) de equino (cavalo) a 10% adicionando 5 mL de ES a 45 mL de 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Conservar a 4 °C.
- Prepare a solução estoque de albumina de soro bovino (BSA) a 4% adicionando 2 g de pó de BSA a 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e levando-a a um volume final de 45 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Conservar a 4 °C.
- Prepare a solução estoque de papaína diluindo a papaína a 3 mg / mL em 1x HBSS. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Conservar a -20 °C.
- Prepare a solução de desoxirribonuclease (DNase) adicionando 20 mg de pó de DNase ao H2O estéril e levando-o a um volume final de 20 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Conservar a -20 °C.
- Preparar uma solução-mãe de ácido ascórbico adicionando 352 mg de ácido ascórbico ao H2O destilado estéril e levando-o a um volume final de 20 ml. Se necessário, aquecer num banho a 37 °C para dissolver. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Conservar a -20 °C.
- Prepare o meio de cultura celular adicionando o seguinte a 50 mL de meio neurobasal: 500 μL de Glutamax (100x), 500 μL de soro equino, 1 mL de B-27, 100 μL de ácido ascórbico, 500 μL de penicilina-estreptomicina, 50 μL de canamicina e 50 μL de ampicilina. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
- Prepare a solução de Triton X-100 a 0,01% adicionando 1 mL de Triton X-100 em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 10%. Como o Triton X-100 é viscoso, pipete lentamente para permitir que a ponta se encha completamente. Aquecer num banho a 37 °C para dissolver, se necessário. Conservar a 4 °C.
- Para diluir 10% do estoque Triton X-100 para 0,01%, execute 3 diluições seriais 1:10. Dilua 1 mL de estoque a 10% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 1%. Dilua 1 mL de solução a 1% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 0,1%. Dilua 1 mL de solução a 0,1% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 0,01%.
- Prepare soluções de soro de cabra normal (NGS) a 10% e 1% adicionando 1 mL de NGS a 9 mL de 1x PBS para uma solução a 10% e 100 μL de NGS a 9,9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 1%.
- Preparar uma solução-mãe de glutamato (100 mM) adicionando 735 mg de ácido L(+)-glutâmico ao H2O destilado estéril e levando-o a um volume final de 50 ml. A solubilidade nessa concentração será um problema. A adição de pequenos volumes (100 μL) de ácido clorídrico 1 M é suficiente para aumentar a solubilidade.
- Preparar a solução-mãe de NBQX (10 mM) adicionando 50 mg de NBQX ao H2O destilado estéril e levando-o a um volume final de 13 ml.
2. Preparação de pratos de cultura e lamínulas (Feito no dia anterior à dissecação)
NOTA: Descobrimos que a combinação de três agentes de revestimento, poli-L-lisina, poli-L-ornitina e laminina, permite a adesão e viabilidade celular ideais.
- Coloque 10 placas de Petri de 35 mm em uma cabine de segurança biológica. Coloque duas lamínulas circulares de 12 mm em cada prato e encha com 70% de EtOH por 10 min. Use uma linha de vácuo para aspirar o EtOH restante de cada prato, permitindo que o EtOH evapore completamente.
- Pipete ~ 90-100 μL de solução de poli-L-lisina a 0,1% em cada lamínula, certificando-se de que toda a lamínula esteja coberta. Cubra a loiça com tampas e coloque-a numa incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Aspirar a solução de poli-L-lisina restante de cada lamínula e enxaguar com H2O estéril.
- Repita as etapas 2.2 – 2.3 com solução de poli-L-ornitina a 0,1%.
- Novamente, repita as etapas 2.2 – 2.3 com solução de laminina a 0,01%. Colocar numa incubadora a 37 °C/5% de CO2 até estar pronto para a plaqueagem celular no dia seguinte.
3. Dissecções embrionárias de camundongos
NOTA: Usamos entre 4 a 6 camundongos prenhes cronometrados por cultura. Embora grande parte do processo de dissecação ocorra fora de um gabinete de segurança biológica, ainda é importante manter um procedimento estéril. O uso abundante de EtOH a 70% em superfícies próximas ao microscópio de dissecção e em ferramentas cirúrgicas é o ideal. Uma máscara também pode ser usada durante a dissecação para evitar ainda mais a contaminação. Além disso, usamos 4 antibióticos separados no meio de cultura, portanto, a contaminação é improvável. No entanto, se o uso de antibióticos for problemático, essa configuração de dissecção pode ser movida para dentro de um capuz estéril. Para preservar a viabilidade celular, todas as soluções de dissecação devem ser pré-resfriadas a 4 °C e as dissecações devem ser concluídas o mais rápido possível. Não realizamos as dissecações no gelo. O método de dissecção de neurônios do mesencéfalo embrionário de camundongos é idêntico aos métodos descritos anteriormente.
- Prepare um espaço em uma bancada perto de um microscópio de dissecção com uma almofada absorvente e borrife generosamente com EtOH 70%.
- Pulverizar duas placas de Petri de vidro de 100 x 15 mm e uma placa de Petri de vidro de 50 x 10 mm com 70% de EtOH e deixar evaporar a EtOH. Depois de evaporado, coloque 50 mL de 1x HBSS estéril em cada placa de Petri de 100 x 15 mm.
- Mergulhe tesouras cirúrgicas, pinças e lâmina de micrótomo em EtOH 70% por no mínimo 10 min para esterilizar. Coloque os instrumentos na almofada absorvente para secar.
- Usando CO2 seguido de luxação cervical, eutanasiar camundongos com gravidez cronometrada de 2 a 3 meses de idade no dia embrionário 14.
- Pulverize o abdômen dos camundongos sacrificados com 70% de EtOH. Usando uma pinça, agarre a parte inferior do abdômen e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura cirúrgica. Comece a cortar perto de onde a pinça está segurando o abdômen, fazendo cortes laterais de cada lado até que a parede abdominal possa ser dobrada para trás e o útero fique claramente visível.
- Usando uma tesoura cirúrgica, corte as duas extremidades do corno uterino. Em seguida, remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri com 1x HBSS.
- Usando pinças de ponta reta, remova cuidadosamente os embriões do útero. Deixe os embriões no HBSS durante todo este processo. Usando a pinça ou uma lâmina de micrótomo, decapite rapidamente os embriões cortando perto do pescoço. Fazendo um corte o mais nivelado possível.
- Sob um microscópio de dissecação, mova a cabeça de um embrião para uma placa de Petri seca de 50 mm e coloque-a no lado ventral. Estabilize a cabeça com uma pinça, colocando e penetrando perto dos olhos/focinho. A pinça deve ser inclinada para baixo em ~45° para evitar penetrar no mesencéfalo.
- Usando a pinça, por outro lado, remova cuidadosamente a camada translúcida de pele e crânio logo antes da crista proeminente do mesencéfalo. Comece perto da linha média e remova a pele e o crânio caudalmente até que o mesencéfalo esteja totalmente exposto.
- Segure a pinça perpendicular ao mesencéfalo exposto, com uma ponta entre o córtex e o mesencéfalo e a outra perto do cerebelo. Pressione e aperte a pinça para remover todo o mesencéfalo. O segmento do mesencéfalo deve ter aproximadamente 0,5 mm de espessura. Coloque o segmento do mesencéfalo na segunda placa de Petri cheia de 1x HBSS fresco. Repita esse processo para cada embrião.
- Usando o microscópio de dissecação, posicione o segmento cerebral com o lado ventral voltado para cima. Se as meninges ainda estiverem presas, remova-as com cuidado, agarrando-as com a pinça e levantando-as para cima e para longe do segmento cerebral.
- O segmento cerebral deve ter 4 quadrantes visíveis. Coloque o segmento de tal maneira que os dois quadrantes menores sejam posicionados acima dos dois quadrantes maiores. Há uma crista proeminente separando os dois quadrantes superiores (pequenos) dos dois quadrantes inferiores (grandes).
- Usando a pinça, aperte e separe os quadrantes superiores dos quadrantes inferiores e, em seguida, descarte os quadrantes superiores. Os quadrantes inferiores restantes terão excesso de tecido lateralmente no lado dorsal, este tecido parecerá menos opaco do que o tecido ventral restante. Remova o tecido dorsal menos denso e descarte. O segmento restante deve conter a substância negra pars compacta (SNc) e a área tegmental ventral (VTA).
- Usando a pinça, corte o segmento de tecido ventral restante em 4 pedaços menores e, usando uma pipeta de 1 mL de diâmetro largo, transfira esses segmentos em um tubo cônico de 15 mL com 1x HBSS. Mantenha o tubo cônico com segmentos cerebrais no gelo durante todo o procedimento.
- Repita esse processo para todos os segmentos cerebrais restantes.
4. Dissociação de células
- Digestão enzimática de células
- Aspire cuidadosamente o HBSS do tubo cônico de 15 mL contendo segmentos do mesencéfalo, deixando os segmentos no fundo do tubo.
- Adicione ~ 800 μL de solução de papaína ao tubo e coloque em uma incubadora a 37 ° C por 7 min. Ressuspenda as células sacudindo o tubo e substitua pela incubadora a 37 ° C por mais 7 min.
- Com uma ponta de pipeta de 1 mL de diâmetro largo, remova apenas os segmentos do mesencéfalo em uma alíquota de 1 mL de DNase. Deixe os segmentos atingirem a parte inferior da alíquota ou cerca de 1 min de exposição.
- Com uma ponta de pipeta de 1 mL de diâmetro largo, remova apenas os segmentos do mesencéfalo em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de solução de parada. Deixe os segmentos assentarem no fundo do tubo e repita o enxágue em um tubo cônico adicional cheio de solução de parada.
- Trituração mecânica da suspensão celular
- Na segunda parada, tubo de enxágue da solução, usando uma ponta de pipeta de 1 mL de diâmetro largo, pipetar as células para cima e para baixo 10 vezes até que não haja grandes segmentos de tecido visíveis. É importante evitar a titulação excessiva para lise celular mínima.
- Pipete lentamente 300 μL de solução de BSA a 4% para o fundo do tubo cônico de 15 mL contendo segmentos cerebrais. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta para manter uma camada de suspensão. Centrifugue a 0,4 x g por 3 min. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 400 μL de meio de cultura celular.
5. Revestimento das células
NOTA: Com base na experiência, cerca de 100.000 células viáveis por embrião são coletadas. Camundongos prenhes cronometrados de 2 a 3 meses normalmente têm ninhadas de 8 a 10 embriões; portanto, uma estimativa aproximada para o rendimento total de células por camundongo prenhes cronometrado é de aproximadamente 1 milhão de células.
- Usando um hemocitômetro, faça uma contagem de células e, em seguida, dilua a suspensão para 2.000 células/μL usando um meio de cultura de células. Triturar brevemente para misturar.
- Remova as lamínulas com solução de laminina da etapa 2 da incubadora e aspire a solução de laminina restante das lamínulas revestidas usando um vácuo. Placa rapidamente para evitar que as lamínulas sequem completamente. Pipetar 100 μL (2,0 x 105 células/lamínula) em cada lamínula e colocar placas de Petri numa incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Adicione cuidadosamente 3 ml de meio de cultura celular a cada placa e volte a colocá-lo na incubadora a 37 °C. Realize mudanças meio médias duas vezes por semana durante 2 semanas.
6. Infecção de cultura de células em 14 DIV com vetores virais adeno-associados (AAV)
- Para cada placa, prepare 1 mL de meio DMEM sem soro com 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 título)
- Aspirar o meio de cultura celular de cada placa e substituí-lo por 1 ml de DMEM sem soro contendo hSyn-GCaMP6f. Em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora a 37 °C por 1 h.
- Aspire o meio sem soro contendo AAVs e substitua-o por 3 ml de meio de cultura celular. Colocar a loiça de volta na incubadora a 37 °C. Descobrimos que 5-7 dias de infecção por AAV permitem níveis ideais de expressão de GCaMP. Durante todo este período de infecção viral, continue a mudar o meio a cada 2-3 dias.
7. Imagem confocal Ca2+ ao vivo entre 19-21 DIV
- Preparação de buffers de gravação
- Para fazer 1 L de tampão de registro HEPES, adicione: 9,009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glicose, 2,381 g de HEPES, 2 mL de solução estoque 1 M CaCl2 e 500 μL de solução estoque 1 M MgCl2 a 800 mL de H2O destilado estéril. Traga o pH para 7,4 com NaOH. Leve para um volume final de 1 L.
- Para fazer 200 mL de tampão de registro de glutamato 20 μM, dilua 40 μL de solução estoque de glutamato 100 mM em 200 mL de tampão de registro HEPES descrito acima.
- Para fazer 200 mL de tampão de gravação NBQX 10 μM, dilua 200 μL de solução estoque NBQX 10 mM em 200 mL de tampão de gravação HEPES.
- Imagem confocal
- Encha uma placa de Petri estéril de 35 mm com 3 ml de tampão de registo.
- Remover uma placa de Petri de 35 mm com culturas infectadas da incubadora a 37 °C. Usando uma pinça de ponta fina, pegue cuidadosamente a borda de uma lamínula e transfira-a rapidamente para a placa de Petri cheia de tampão de gravação. Colocar a lamínula restante no meio de volta na incubadora a 37 °C. Transporte a antena com o tampão de registo para o microscópio confocal.
- Inicie o software de imagem. Prossiga para a próxima etapa enquanto ele é inicializado.
- Ligue a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação. Calibre a velocidade do fluxo para 2 mL/min.
- Transferir a lamínula infectada da placa de Petri de 35 mm para o banho de registo.
- Usando a objetiva de imersão em água de 10x e a luz BF, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares de neurônios. Mude para a objetiva de imersão em água de 40x e, usando a luz BF, reoriente a amostra.
- Na janela "Lista de corantes" do FluoView, selecione AlexaFluor 488 e aplique-o.
- A expressão de AAV pode ser variável; portanto, para evitar a superexposição e o fotobranqueamento dos fluoróforos, comece com configurações baixas de HV e potência do laser. Para o canal AlexaFluor 488, defina o alto voltage (HV) para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para 0. Para a linha de laser 488, defina a potência para 5%. Para aumentar o volume efetivo fotografado no plano z, aumente o tamanho do orifício para 300 μm. Use a opção de varredura "foco x2" para ajustar de forma ideal os sinais de emissão para níveis de subsaturação. A partir daqui, as configurações podem ser ajustadas até que a visibilidade ideal de cada canal seja alcançada.
nota: Para capturar com precisão toda a gama de fluxos de Ca2+ com GCaMP, ajuste as configurações de potência de HV e laser de linha de base para permitir um aumento na intensidade fluorescente sem saturar demais o detector.
- Depois que as configurações do microscópio forem otimizadas, mova a platina para localizar uma região com várias células exibindo alterações espontâneas na fluorescência do GCaMP6f e concentre-se no plano desejado para a imagem.
- Use a ferramenta "Recortar reto" para recortar o quadro de imagem em um tamanho que possa atingir um intervalo de quadros de pouco menos de 1 segundo. Isso é necessário para definir o intervalo de imagem em 1 quadro por segundo.
- Defina a janela "Intervalo" para um valor de 1,0 e a janela "Num" para 600.
nota: Para fornecer diferentes buffers de gravação no ponto de tempo desejado (300 s), é importante calibrar a latência da bomba para fornecer a nova solução ao banho. Isso dependerá da taxa de perfusão da solução (2 mL / min) e do comprimento da linha usada para bombear a solução.
- Para capturar um filme da série T, selecione a opção "Tempo" e, em seguida, use a opção de digitalização "XYt" para iniciar a geração de imagens.
- Observe a barra de progresso da imagem e mova a linha do buffer de gravação HEPES para o buffer de gravação de glutamato de 20 μM no ponto de tempo apropriado (por exemplo, se a latência da bomba estiver calibrada para fornecer solução a 60 s, mova a linha para o tampão de glutamato a 240 quadros para fornecer glutamato a 300 s).
- Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão Série concluída e guarde o filme da série t finalizado. Continue a perfundir 20 μM de glutamato por mais 5 minutos, de modo que os neurônios cultivados tenham sido expostos ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita esse processo para cada lamínula a ser fotografada.
- Após a exposição adicional de 5 minutos a 20 μM de glutamato, remova a lamínula do banho e coloque-a de volta na placa de Petri de 35 mm contendo o tampão de registro até que o dia da imagem seja concluído.