Preparando fatias de córtex rinal-hipocampo de um cérebro de filhote de rato

Resumo

Fonte: Valente, C. A., et al., Um modelo de epileptogênese em culturas de fatias organotípicas do córtex rinal-hipocampo. J. Vis. Exp. (2021)

O vídeo demonstra um método para obter fatias de córtex rinal-hipocampo do cérebro de um filhote de rato e cultivá-las em inserções membranosas dentro de uma placa de vários poços cheia de mídia para análise posterior.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo

NOTA: A preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo usa ratos P6-7 Sprague-Dawley.

1. Configuração da cultura e preparação do meio
   1. Na véspera da cultura, preparar os meios necessários e colocá-los a 4 °C.
   2. Prepare o meio de dissecação: 25 mM de glicose em solução salina balanceada Gey's (GBSS).
   3. Prepare o meio de cultura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Horse Serum (HS), 25 mM de glicose, 30 μg / mL de gentamicina.
   4. Prepare o meio de manutenção: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
2. Colheita de cérebros
   1. Imediatamente antes de iniciar a cultura, adicione 1,1 mL de meio de cultura a cada poço da placa de 6 poços com uma pipeta P1000 e coloque-o a 37 °C.
   2. Coloque todo o equipamento (microscópio de dissecação, picador de tecidos, lâmpada de dissecação, ferramentas de dissecação, eletrodos, placas, inserções e papéis de filtro) dentro do armário de segurança biológica e esterilize sob luz ultravioleta por 15 minutos.
   3. Ajuste a espessura da fatia para 350 μm.
   4. Retire o GBSS da geladeira. Adicione 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Serão necessárias seis placas de Petri por animal.
   5. Eutanasiar o filhote de rato. Realize a decapitação usando uma tesoura afiada na base do tronco cerebral do animal.
   6. Lave a cabeça do animal três vezes em GBSS frio e leve-a para dentro do armário de segurança.
3. Isolamento de tecidos e preparação de fatias
   1. Insira firmemente uma pinça afiada nas órbitas oculares para segurar a cabeça.
   2. Usando uma tesoura fina, corte a pele/couro cabeludo ao longo da linha média, começando do forame vertebral em direção aos lobos frontais e coloque-o de lado.
   3. Corte da mesma forma que o crânio e ao longo da fissura transversal cerebral (espaço entre o cérebro e o cerebelo). Com pinça longa curva, afaste-a.
   4. Descarte os bulbos olfatórios com uma espátula. Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal voltada para cima (Figura 1A).
   5. Insira a pinça fina no cerebelo e siga ao longo da linha média com a espátula abrindo cada hemisfério com muito cuidado (Figura 1B).
   6. Com pinças de curva curta, remova cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampo, sem tocar na estrutura do hipocampo. Em seguida, com uma espátula, corte abaixo de cada hipocampo (Figura 1C).
   7. Pegue um hemisfério e coloque-o, com o hipocampo voltado para cima, em um papel de filtro. Repita o procedimento com o outro hemisfério e coloque-o paralelo ao primeiro, no papel de filtro. Coloque o papel de filtro no picador de tecidos, com os hemisférios perpendiculares à lâmina, e corte os hemisférios em fatias de 350 μm (Figura 1D).
   8. Coloque o tecido fatiado em uma placa de Petri com GBSS frio (Figura 1E).
   9. Separe cuidadosamente as fatias usando os eletrodos de ponta redonda (Figura 1F). Mantenha apenas as fatias com córtex rinal e hipocampo estruturalmente intactos. As áreas DG e AC devem estar perfeitamente definidas, assim como o córtex entorrinal e peririnal (Figura 1G).
   10. Coloque cada fatia no inserto (Figura 1H-I), com uma espátula e um eletrodo de ponta redonda. Remova o excesso de meio de dissecção ao redor de cada fatia com uma pipeta P20 (Figura 1J). Quatro fatias do córtex rinal do hipocampo podem ser cultivadas em uma única inserção (Figura 1K).
4. Manutenção da cultura
   1. Mude o meio a cada dois dias.
   2. Aquecer o meio a 37 °C.
   3. Retire as placas da incubadora. Pegue cada inserto segurando a borda plástica com uma pinça (Figura 1L).
   4. Use a mão livre para aspirar o meio do poço. Coloque o inserto de volta no poço e adicione 1 mL, com uma pipeta P1000, de meio fresco aquecido (Figura 1M). Repita para todas as inserções. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas entre a membrana e o meio.

Resultados

Figura 1: Procedimento detalhado para a preparação de fatias organotípicas de córtex rinal-hipocampo. (A) Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal voltada para cima. (B) Insira a pinça no cerebelo. Abra o cérebro através da linha média e remova o excesso de tecido sobre o hipocampo. (C) Com uma espátula cortada ab...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâminas para cabo de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10011-00
Sistema de câmara de fatia de cérebro/tecido	Warner Instruments
Insertos de cultura de células, 30 mm, PTFE hidrofílico	Millipore SAS	PICM03050
Incubadora convencional	Thermo Scientific Heraeus	BB15, linha de função	Defina para 37 °C e 5% de CO2
D(+)-Glicose monohidratada	Merck Millipore	Rolamento 1.08342.1000
Solução de D-(+)-glicose, 45% em água	sigma	G8769
hidrogenofosfato di-sódico di-hidratado	Merck Milipore	Rolamento 1.06580.1000
Dumont #5 Pinça Fina Biologie Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11254-20
Fórceps Dumont #5 Standard Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11251-20
Dumont #7 Fórceps Padrão Dumoxel	Ferramentas de Belas Ciências	11271-30
Fórceps de #7S Médica Dumont Curva Curta Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11273-22
Solução-mãe de gentamicina, 50 mg/ml	Thermo Fisher Científico	15750-037
Solução salina balanceada de Gey (GBSS)	Indústrias Biológicas	01-919-1A
Eletrodos de vidro	Produtos Científicos	GB150F-10	Dicas redondas caseiras
Pipetas Pasteur de vidro, 230 mm	VWR Internacional	Nº 612-1702
Soro de cavalo, inativado por calor (HS)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 26050-088
Espátula de íris curva	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10092-12
Gabinete de Segurança Biológica Classe II para Labcultura	HERASafe	HS 12
Solução de L-Glutamina 200 mM (Q)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 25030-024
Meio Neurobasal-A (NBA)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 10888-022
Opti-MEM® I Meio de Soro Reduzido	Thermo Fisher Científico	Rolamento 31985-047
Platina 5 lâminas	Gillette
Papel de Filtro Qualitativo, Celulose, Grau 1, 55 mm	O que homem	1001-055	Retenção média 11μm
Papel de Filtro Qualitativo, Celulose, Grau 1, 90 mm	O que homem	Rolamento 1001-090	Retenção média 11μm
Cabo de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências	91003-12
Placas estéreis de 6 poços tratadas com TC	Corning	CORN3516
Controlador de temperatura	SISTEMAS MÉDICOS CORP.	TC-102
Picador de tecidos	O Laboratório Mickle Engineering CO. LTD.	MTC/2	Defina para 350 μm