Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK
- Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de irmãos de ninhada; TRPV1wt::D TAfl/wt) e camundongos ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt) cruzando camundongos com toxina diftérica lox-stop-lox-(DTAfl/fl) com camundongos TRPV1cre/wt.
- Usando a inalação de CO2, eutanasiar um camundongo controle de ninhada ingênuo (TRPV1wt: :D TAfl / wt).
- Colete o baço em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
- Homogeneizar o baço com um pilão.
- Dilua as células com 1 mL de PBS estéril.
- Filtrar a mistura através de um filtro de células de 50 μm para um tubo cónico de 15 ml.
- Complete o volume (10 mL) com PBS estéril.
- Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
- Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e retirar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células a uma concentração de 108 células / mL em um meio RPMI 1640 suplementado.
- Siga as instruções do fabricante para purificar magneticamente as células Natural Killer (NK) do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo. Confirme a pureza da célula NK usando citometria de fluxo.
- Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
- Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e retirar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células NK em um meio de cultura RPMI 1640 suplementado (contendo IL-2 e IL-15).
- Cultura 2 × 106 células NK/mL em uma placa de fundo em U de 96 poços por 48 h.
2. Isolamento e cultura de neurônios DRG
- 24 h antes do final da estimulação das células NK (etapa 1.15), cubra uma placa de 96 poços com 100 μL / poço de laminina (1 ng / mL) e incube por 45 min (37 ° C).
- Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar em um gabinete de biossegurança.
- Usando a inalação de CO2, eutanasiar o neurônio nociceptor intacto (controle da leitegada; TRPV1wt::D TAfl/wt) ou camundongos ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt).
NOTA: A inalação de CO2 é preferível à luxação cervical, pois evita a ruptura dos nervos espinhais conectados ao DRG (gânglio da raiz dorsal).
- Prenda o mouse no tabuleiro em uma posição de bruços, levante a pele e incise a pele ao longo da coluna dorsal.
- Corte a articulação lombossacral e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.
- Separe a coluna cortando os músculos e costelas de ambos os lados da coluna na direção cranial até que a base do crânio seja alcançada.
- Usando uma tesoura, corte a coluna na articulação atlanto-occipital.
- Remova o músculo e o tecido adiposo da coluna.
- Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal e obter acesso ao DRG. Procure o DRG no forame intervertebral conectado à medula espinhal através da raiz dorsal, mas separado das meninges.
- Colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mL cheio de 10 mL de DMEM suplementado com gelo.
- Centrifugar a preparação (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e retirar o sobrenadante.
- Adicione 250 μL de PBS contendo colagenase IV (1 mg / mL) e Dispase II (2,4 U / mL).
- Incube o DRG com solução de colagenase IV / Dispase II (C / D) (80 min, 37 ° C, agitação leve). Ao agrupar gânglios de vários camundongos, mantenha uma proporção de 125 μL de solução C / D por gânglio.
- Para inativar as enzimas, adicione 5 mL de meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado.
- Centrifugue a solução (200 × g, 5 min) e remova suavemente o sobrenadante com uma pipeta.
- Para evitar perda de células indesejadas, deixe ~ 100 μL do sobrenadante.
- Adicione 1 mL de meio DMEM suplementado.
- Usando uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes, triture suavemente (~ 10 para cima/para baixo por tamanho de pipeta Pasteur) o DRG em uma preparação de célula única.
- Em um gabinete de biossegurança, dilua a albumina de soro bovino (BSA) em PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) até uma concentração final de 15%. Armazene alíquotas de 1 mL a -20 °C.
- Crie um gradiente de BSA em um tubo cônico de 15 mL adicionando 2 mL de PBS estéril e dispensando lentamente 1 mL de solução de BSA a 15% na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.
- Usando uma pipeta P200, pipete lentamente a suspensão de gânglios triturados (que contém os neurônios) na lateral do tubo no gradiente.
- Centrifugar o gradiente BSA contendo neurónios (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Defina a aceleração e desaceleração da centrífuga para a velocidade mínima.
NOTA: Após a centrifugação, os neurônios estarão no fundo do tubo, enquanto os detritos celulares ficarão presos no gradiente BSA.
- Remova cuidadosamente todo o sobrenadante usando uma pipeta.
- Ressuspenda as células em 500 μL de Neurobasal.
- Placa 104 neurônios por poço (200 μL de neurobasal/poço) em uma placa de 96 poços revestida com laminina e fundo plano.
NOTA: Em média, um investigador será capaz de preencher ~ 8 poços por camundongo.
- Cultive os neurônios (37 ° C, durante a noite) para permitir a fixação.
3. Co-cultura
- Remova lentamente o neurobasal da cultura de neurônios.
- Após 48 h de estimulação com IL-2 e IL-15 (ver passos 1.14-1.15), ressuspenda as células NK e adicione 105 células NK/poço à cultura de neurónios (placa de fundo plano de 96 poços).
NOTA: Em média, o investigador será capaz de encher ~ 6 poços por camundongo.
- Co-cultura das células em MX neurobasal suplementado (37 ° C, 48 h).
