Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

Resumo

Fonte: Er, S., et al. Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibrilas pré-formadas em neurônios dopaminérgicos primários do mesencéfalo de camundongos. J. Vis. Exp. (2020).

O vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos. Os assoalhos do mesencéfalo ventral isolados são dissociados usando enzimas. Os neurônios dopaminérgicos resultantes são colhidos e transferidos para micro-ilhas dentro de placas de vários poços. As células são incubadas com um meio de neurônio dopaminérgico para manter as células em alta densidade dentro das micro-ilhas.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação

1. Prepare o meio neurônio dopaminérgico (DPM) com 0,46% de D-glicose, 1% de L-glutamina, 1% de N2, 0,2% de primocina, completado com a mistura de meio/nutriente Eagle modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12). Filtre o DPM depois de misturar os ingredientes. Armazene o DPM a 4 °C e aqueça cada alíquota apenas uma vez.
   nota: O DPM não deve conter o fator de crescimento derivado da linhagem de células gliais (GDNF), pois reduzirá o acúmulo de α-sinucleína nos neurônios dopaminérgicos.
2. Prepare pipetas de vidro siliconizadas que são extremamente hidrofóbicas, minimizando assim a fixação à superfície e a perda de células durante o manuseio inicial dos neurônios embrionários.
   1. Adicione 10 mL de fluido siliconizante a 1 L de água destilada e misture mexendo em um recipiente de 2 L. Deixe as pipetas de vidro imersas na solução de siliconização por 15 min.
   2. Enxágue as pipetas 3–5x com água destilada. Seque as pipetas durante a noite em temperatura ambiente (RT) ou por 1 a 2 h a 100-120 °C em um espaço estéril aquecido para acelerar a secagem.
   3. Esterilize as pipetas por autoclave padrão em um saco de autoclave lacrado.
3. Prepare placas de 96 poços revestidas com poli-L-ornitina (PO) com fundo transparente, adicionando 60 μL de solução de PO nos poços intermediários da placa de 96 poços a serem usados para semear os neurônios, deixando pelo menos uma linha / coluna de poços nas bordas da placa para evitar efeitos de borda. Manter a placa revestida durante a noite a 4 °C ou 4 h em RT.
4. Antes de plaquear as células, aspire PO completamente e lave as células três vezes com 100 μL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS). Aspire 1x PBS dos poços e mantenha a tampa da placa aberta para secagem completa.
   nota: É possível coletar o pedido usado e filtrá-lo para reutilização. Isso pode ser repetido duas vezes para a mesma solução de PO.
5. Adicione 50 μL de DPM aos poços previamente revestidos. Aspire o DPM dos poços com uma ponta plástica de 100 μL e, simultaneamente, arranhe o fundo do poço com movimentos circulares para remover o revestimento no perímetro de cada poço. Uma ilha revestida de PO permanecerá no meio do poço.
6. Sob uma capa laminar, adicione 10 μL de DPM ao meio de cada ilha revestida para criar micro ilhas.
   nota: Uma placa com micro ilhas cobertas com DPM pode ser mantida sob a capela de fluxo laminar por 1–2 h durante o isolamento das células

2. Isolamento do assoalho do mesencéfalo ventral de embriões embrionários do dia 13.5 (E13.5) de camundongos

1. Antes da dissecação, encha uma placa de Petri de 10 cm com tampão de Dulbecco e mantenha-a no gelo.
2. Eutanasiar um camundongo fêmea grávida E13.5 de acordo com as diretrizes da instituição. Coloque o camundongo deitado de costas e borrife a parte anterior do corpo com etanol a 70%. Levante a pele acima do útero com uma pinça e faça uma incisão com uma tesoura cirúrgica para expor o útero.
3. Remova cuidadosamente o útero e coloque-o na placa de Petri previamente preparada no gelo.
4. Usando uma tesoura cirúrgica sob o capuz laminar em RT, remova cuidadosamente os embriões do útero. Remova todos os resíduos placentários dos embriões com uma pinça e coloque-os em uma nova placa de Petri de 10 cm cheia de tampão de Dulbecco.
5. Usando pinças de dissecação ou agulhas, corte o traseiro da cabeça dos locais marcados com setas pretas na Figura 1A. Retire o pedaço cortado do resto do embrião (Figura 1B).
6. Coloque a parte posterior da peça cortada em direção ao observador (Figura 1C) e corte-a suavemente da caudal para o cranial (Figura 1D). De 0,5 mm abaixo da abertura craniana, corte uma região de 2 mm² –3 mm², mostrada na Figura 1E.
7. Colete o assoalho ventral do mesencéfalo (ver Figura 1F) em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mL. Mantenha o tubo da microcentrífuga no gelo até que todos os assoalhos do mesencéfalo estejam coletados nele.
   nota: Alternativamente, os assoalhos do mesencéfalo podem ser coletados com uma micropipeta de 1 mL após a dissecção de todos os cérebros embrionários.

3. Estabelecimento de culturas primárias do mesencéfalo embrionário de embriões de camundongos E13.5 em formato de placa de 96 poços

1. Após a coleta do assoalho do mesencéfalo de todos os embriões no mesmo tubo de 1,5 mL, remova o tampão de Dulbecco residual e lave os pedaços de tecido três vezes com 500 μL de Ca2⁺, Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS) livre de Mg2⁺.
2. Remova o HBSS e adicione 500 μL de tripsina a 0,5% ao tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Durante a incubação, aqueça 1,5 mL de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C, adicione 30 μL de DNase I ao FBS e misture. Além disso, polir a ponta de uma pipeta de vidro siliconizada. Certifique-se de que o orifício não tenha bordas afiadas e tenha aproximadamente o mesmo tamanho de uma ponta de micropipeta de 1 mL.
   nota: Como alternativa, uma ponta de micropipeta de 1 mL de baixa adesão pode ser usada para trituração. No entanto, as pipetas de vidro siliconizadas parecem dar os melhores resultados.
4. Assim que a incubação na etapa 3.2 terminar, adicione 500 μL da mistura FBS / DNase ao tecido parcialmente digerido. Use a pipeta de vidro para triturar o tecido na mistura FBS / tripsina. Triturar até que os tecidos se dissociem em partículas minúsculas e pouco visíveis. Evite bolhas durante a trituração.
5. Deixe as partículas restantes precipitarem no fundo do tubo da microcentrífuga por gravidade. Sem pipetar o precipitado no fundo, recolher o sobrenadante para um tubo cónico vazio de polipropileno de 15 ml.
6. Dilua FBS/DNase I da etapa 3.3 (98:2) com 1.000 μL de HBSS para obter FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Misture pipetando para cima e para baixo. Adicione 1.000 μL da nova mistura às partículas restantes no tubo da microcentrífuga. Triture novamente e repita a etapa 3.5.
7. Repita a etapa anterior mais uma vez para usar todos os FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Uma vez que todo o sobrenadante é coletado dentro do tubo de 15 mL (das etapas 3.5, 3.7 e 3.8), use uma centrífuga de mesa para girar o sobrenadante (~ 3 mL) a 100 x g, por 5 min. Remova o sobrenadante sem tocar nas células peletizadas na parte inferior.
9. Lave o pellet celular adicionando 2 mL de DPM ao tubo e gire-o a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e repita a lavagem 2x para minimizar os detritos nas células peletizadas.
   nota: Sempre use DPM fresco e aquecido para os neurônios cultivados. Para as etapas de lavagem, o DPM não precisa ser fresco, mas deve ser pré-aquecido a 37 °C.
10. Diluir as células com DPM fresco e quente e transferi-las para um tubo de microcentrífuga. A quantidade de DPM para diluição depende do número de embriões usados para dissecção de tecido. Por exemplo, use 150 μL de DPM para diluir as células obtidas de dez embriões.
11. Transfira 10 μL de células em DPM para um tubo de microcentrífuga. Misture-os com 10 μL de corante azul de tripano a 0,4%. Conte células vivas (ou seja, azul de tripano negativo) usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
    nota: Use 30.000 células para plaqueamento por poço para obter ~ 1.000 neurônios de dopamina por poço. Se a densidade celular for superior a ~ 30.000 células por 6 μL, dilua ainda mais as células com DPM antes do plaqueamento para que o volume de semeadura não seja inferior a 6 μL.
12. Sem tocar no fundo dos poços, remova o DPM das micro ilhas criadas na etapa 1.6.
13. Para obter densidade celular reprodutível em cada poço, misture as células por pipetagem suave antes de plaquear no poço. Com uma micropipeta de 1 a 10 μL, adicione 6 μL de células ao meio do poço, no local de cada micro ilha anterior.
14. Encha os poços vazios nas bordas da placa com 150 μL de água ou 1x PBS para minimizar a evaporação dos poços contendo culturas neuronais. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ durante 1 h.
15. Após 1 h, remova a placa da incubadora, adicione 100 μL de DPM em cada poço com células e coloque-o de volta na incubadora.
16. Dois dias após o plaqueamento (dia in vitro 2, ou DIV2), remova 25 μL e adicione 75 μL de DPM fresco para trazer o volume final do meio para 150 μL e evitar a evaporação o máximo possível.
17. Troque metade do meio por DPM fresco (ou seja, remova 75 μL e adicione 75 μL de DPM fresco) em DIV5. Não execute nenhuma alteração de mídia após o DIV5.

Resultados

Figura 1: Dissecção do assoalho do mesencéfalo do embrião de camundongo E13.5. (A) Os locais de corte no quarto traseiro da cabeça são marcados com setas pretas e linhas tracejadas brancas. (B) O pedaço foi removido do resto do embrião. A peça removida é circulada. (C) A peça foi girada 90° para ficar de frente para o posterior em direção ao observad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,4% de mancha azul de tripano	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
5 M NaOH	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Placa de visualização de 96 poços (preta)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA	6005182
99,5% de etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlândia	N/A
Fluido Siliconizante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	TS-42799
Tubo de microcentrífuga autoclavado de 1,5 ml	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Dispositivo de sonicação Bioruptor	Diagenode, Liège, Bélgica	B01020001
Ca2+, solução salina balanceada de Hank+ livre de Mg2+ (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	14175-053
Pacotes de software CellProfiler e CellAnalyst	N/A	N/A	Software de código aberto gratuito
Centrífuga 5702	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	5702000019
Incubadora de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	N/A
Câmara de contagem	BioRad Inc., Hércules, Califórnia, EUA	1450015
Microscópio de ultra-alta resolução DeltaVision com mesa de ar e gabinete	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EUA	29254706
Desoxirribonuclease-I (Dnase I)	Roche, Basel, Suíça	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	21331–020
Amortecedor de Dulbecco	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA	10500056
D-glicose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	G8769
Tampão de fospoato salino (PBS)	N/A	N/A	Media kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Primocin	InvivoGen, San Diego, Califórnia, EUA	formiga-pm-1, formiga-pm-2
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	Pág. 4957
Tritão X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	Rolamento 2199700