Dissecção e montagem de explantes cerebrais de larvas de moscas-das-frutas

Neste artigo

Resumo

Fonte: Sheng, C., et al. Imagem ao vivo com lapso de tempo e quantificação da dinâmica do ramo dendrítico rápido no desenvolvimento de neurônios de Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a dissecação e montagem de explantes cerebrais de larvas de Drosophila. O sistema nervoso central (SNC), ligado aos discos oculares, é extraído das larvas e, em seguida, montado em uma lâmina de vidro em uma solução salina fisiológica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecando e montando explantes cerebrais larvais

Dissecar cérebros larvais na solução salina externa fisiológica (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucose, 10 mM de sacarose, 5 mM de ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanossulfônico (TES), 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7,2) sob um microscópio de dissecção (poder de ampliação de 4,5x) com dois pares de pinças de dissecção de ponta padrão #5 (11 cm). Use um par de pinças para manter o corpo larval no lugar e o outro para dissecar cuidadosamente o cérebro. Preserve os discos oculares, os lobos cerebrais e o cordão nervoso ventral. Remova os músculos anexados para minimizar os movimentos da amostra durante a imagem.
Prepare uma lâmina de vidro (25 x 75 x 1,0 mm³) e use uma seringa para desenhar uma câmara quadrada com graxa a vácuo.
Adicione 20 μL de solução salina externa à câmara quadrada com barreiras de gordura.
Transfira cérebros larvais dissecados para a câmara na lâmina de vidro usando uma pinça. Ajuste a posição dos cérebros sob o escopo de dissecção para garantir que o lado dorsal esteja voltado para cima.
Cubra a câmara com uma lamínula de vidro (22 x 22 x 0,15 mm³). O cérebro larval está agora montado na lâmina dentro de uma câmara preenchida com a solução salina externa (Figura 1B).
nota: Pressionar suavemente a lamínula confina o cérebro e reduz a deriva da amostra na sessão de imagem subsequente.

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Resultados

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Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo de imagem e quantificação da dinâmica dendrítica. (A) O protocolo contém seis etapas que abrangem preparação de amostras, coleta de imagens, processamento de imagens e quantificação semiautomatizada da dinâmica dendrítica. (B) Um diagrama esquemático ilustrando uma câmara de imagem contendo um explante cerebral larval monta...