Dissecção e montagem de explantes cerebrais de larvas de moscas-das-frutas

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecando e montando explantes cerebrais larvais

1. Dissecar cérebros larvais na solução salina externa fisiológica (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucose, 10 mM de sacarose, 5 mM de ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanossulfônico (TES), 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7,2) sob um microscópio de dissecção (poder de ampliação de 4,5x) com dois pares de pinças de dissecção de ponta padrão #5 (11 cm). Use um par de pinças para manter o corpo larval no lugar e o outro para dissecar cuidadosamente o cérebro. Preserve os discos oculares, os lobos cerebrais e o cordão nervoso ventral. Remova os músculos anexados para minimizar os movimentos da amostra durante a imagem.
2. Prepare uma lâmina de vidro (25 x 75 x 1,0 mm³) e use uma seringa para desenhar uma câmara quadrada com graxa a vácuo.
3. Adicione 20 μL de solução salina externa à câmara quadrada com barreiras de gordura.
4. Transfira cérebros larvais dissecados para a câmara na lâmina de vidro usando uma pinça. Ajuste a posição dos cérebros sob o escopo de dissecção para garantir que o lado dorsal esteja voltado para cima.
5. Cubra a câmara com uma lamínula de vidro (22 x 22 x 0,15 mm³). O cérebro larval está agora montado na lâmina dentro de uma câmara preenchida com a solução salina externa (Figura 1B).
   nota: Pressionar suavemente a lamínula confina o cérebro e reduz a deriva da amostra na sessão de imagem subsequente.

Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo de imagem e quantificação da dinâmica dendrítica. (A) O protocolo contém seis etapas que abrangem preparação de amostras, coleta de imagens, processamento de imagens e quantificação semiautomatizada da dinâmica dendrítica. (B) Um diagrama esquemático ilustrando uma câmara de imagem contendo um explante cerebral larval montado com o lado dorsal para cima. O explante cerebral tem um neurônio lateral ventral (LNv) marcado individualmente em cada lobo e é imerso na solução salina externa. As barreiras de graxa a vácuo suportam o peso da lamínula e formam uma pequena câmara que impede o cérebro de se mover.