Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas em Células Progenitoras Neurais

Resumo

Fonte: Phillips, A. W., et al. Desenvolvimento de corpos embrióides livres de soro derivados de HiPSC para o interrogatório de culturas de células-tronco 3-D usando ensaios fisiologicamente relevantes. J. Vis. Exp. (2017).

O vídeo demonstra uma técnica para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) em células progenitoras neurais (NPCs). Inicialmente, os hiPSCs são cultivados em uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs). Posteriormente, as células são destacadas e transferidas para uma placa revestida com biopolímero para permitir que os MEFs adiram e se separem dos hiPSCs. Os hiPSCs suspensos são então transferidos para uma placa de fundo em V e centrifugados para formar agregados. Finalmente, a adição de um meio de diferenciação induz a diferenciação de hiPSCs dentro do agregado em NPCs.

Protocolo

1. Geração de células progenitoras neurais

1. Manter hiPSCs derivados de fibroblastos e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em placas de 6 poços em uma camada de células alimentadoras embrionárias de camundongo (MEF) irradiadas com γ em meio iPSC humano suplementado com pequenas moléculas.
   NOTA: A manutenção diária é uma versão modificada dos procedimentos relatados anteriormente.
   1. Aplique 6 x 10⁵ MEFs em cada poço de uma placa de grau de cultura de tecidos de 6 poços em 300 μL/meio recomendado para poço (seguindo o protocolo do fabricante).
   2. Após 48 h, substitua o meio MEFs por 300 μL/meio hiPSC por 1 h antes de adicionar hiPSCs.
   3. Descongele rapidamente os hiPSCs em banho-maria a 37 °C e adicione lentamente 1 mL de hiPSC médio gota a gota. Transfira os hiPSCs e o meio para um tubo cônico de 15 mL. Adicione o meio para trazer o volume total para 5 mL. Centrifugue por 4 min a 129 x g, aspire o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet em meio hiPSC de 1 mL com inibidor de proteína quinase associada a Rho (ROCK) na concentração de 1:1.000.
   4. Plaquear a suspensão celular (normalmente semeada a 300.000 células/poço) na camada de células MEF e incubar a 37 °C, 5% de CO₂, 95% de umidade.
   5. Monitore a cultura de iPSC de perto usando um microscópio óptico. Após 48 h, remova as culturas que têm bordas irregulares, cresceram para se tornarem císticas ou parecem marrom-amareladas ao microscópio óptico para minimizar a diferenciação espontânea.
      nota: Após 7 a 10 dias, as colônias de hiPSC devem se formar. As colônias devem ser redondas, com bordas claramente definidas e densidades celulares uniformes, e desprovidas de células não uniformes frouxamente compactadas.
   6. Selecione manualmente colônias hiPSC redondas para limpar a cultura de células diferenciadas espontaneamente. Expanda as colônias colocando-as em camadas frescas de MEF. Expanda 1:3 a cada 7 dias quando as culturas se aproximarem da confluência e congelarem.
2. Após a expansão e congelamento das células (para backup), cultive colônias de hiPSC nas placas até atingirem 50 - 75% de confluência.
3. Sete dias após o plaqueamento, use tratamento enzimático suave (5-10 min com 300 μL de solução enzimática) e trituração suave (2-4 vezes com uma pipeta de 1.000 μL) para colher e preparar hiPSCs para diferenciação de células precursoras neurais.
4. Centrifugue a suspensão celular a 129 x g por 4 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio iPSC humano de 5 mL. Transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de células de 5 cm revestida com gelatina a 0,1% por 1 h a 37 °C para eliminar os MEFs e maximizar o rendimento do hiPSC. Transfira o meio (com células não aderentes) para outro prato revestido de gelatina de 5 cm.
5. Transfira as células não aderentes para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta de transferência. Enxágue suavemente as placas com 3 mL de meio e adicione-o ao tubo de 15 mL.
6. Centrifugue a suspensão celular a 129 x g por 4 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em meio. Determine a contagem de células usando um contador de células automatizado. Placa de 9.000 células/poço em uma placa de fundo em V de baixa adesão de 96 poços.
7. Centrifugue a placa a 163 x g durante 3 min. Incube a placa a 37 °C, 95% de humidade e 5% de CO₂. Usando uma pipeta, troque 50% do meio em dias alternados, removendo metade do meio e substituindo-o por meio diferenciador fresco quimicamente definido 1 (DM1; Figura 1; Tabela de Materiais) por 14 dias.

Resultados

Figura 1: Esquema descrevendo as etapas iniciais na preparação de SFEBs. Após a colheita das iPSCs usando uma dissociação enzimática, elas são semeadas em placas de 96 poços e centrifugadas a 163 x g por 3 min para induzir uma agregação rápida. Após 14 dias, os agregados celulares in vitro (DIV) podem ser transferidos de placas de 96 poços por meio de pipetas de furo largo para placas de 6 poços cont...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de cultura de células de diferenciação neuronal SFEB. Reagentes. Componentes
Meio de Indução Neural STEMdiff (Mídia hiPSC)	Tecnologias STEMCELL	0-5835	250ml
Meio PluriQ ES-DMEM (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Componentes de mídia DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax líquido, 1:1	Invitrogen	10565018	385ml
Reposição de soro nocaute	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Caneta / estreptococos	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM 10 mM (100X), líquido	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	Invitrogen	21985023	900ul
Moléculas pequenas
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10uM
Componentes/Materiais
Fibroblastos embrionários de camundongos	GlobalStem	GSC-6301G
96 poços V inferior w/Tampas	sempre-verde	222-8031-01V
Reagente de dissociação celular StemPro Accutase	ThermoFisher	A1110501
fundo plano de 6 poços	falcão	353046