Desenvolvimento e manutenção de corpos embrióides livres de soro

Resumo

Fonte: Phillips, A. W., et al. Desenvolvimento de corpos embrióides livres de soro derivados de HiPSC para a interrogação de culturas de células-tronco 3-D usando ensaios fisiologicamente relevantes. J. Vis. (2017).

O vídeo descreve o procedimento para o desenvolvimento de corpos embrióides livres de soro (SFEBs) a partir de células progenitoras neuronais usando vários meios de diferenciação sem soro ou DM. O DM-2 facilita a maturação e o arranjo dos neurônios para formar SFEBs, enquanto o DM-3 é usado para manutenção do crescimento.

Protocolo

1. Indução de Corpo Embrióide Livre de Soro (SFEB) (Figura 1)

1. Coloque inserções de cultura de células de 40 μm em placas de 6 poços e adicione 1 mL de meio de diferenciação 1 (DM1) (Tabela de Materiais) pelo menos 1 h antes de adicionar agregados.
2. Transfira os agregados de células progenitoras neurais com meio de 20 μL usando uma ponta de boca de 200 μL de largura para insertos de cultura de células de 40 μm e altere o meio para DM2 (Tabela de Materiais).
   nota: As inserções de cultura de células são inserções especializadas que ficam ligeiramente fora do fundo do poço e consistem em uma membrana de politetrafluoretileno suspensa em uma estrutura de plástico. Esta membrana é biocompatível e pode sustentar eficientemente o transporte de nutrientes e oxigênio para os SFEBs colocados no topo. Eles são comumente usados com culturas organotípicas de fatias de hipocampo retiradas de um camundongo ou rato.
   1. Transfira 4-6 agregados para um inserto de cultura de células e deixe um espaço adequado entre os agregados. Remova o máximo de solução em excesso possível usando uma ponta de pipeta fina (por exemplo, ponta de 200 μL).
      NOTA: É aceitável perturbar brevemente o SFEB, pois ele se moverá no inserto da cultura de células à medida que a solução for removida ao redor dos SFEBs.
   2. Manter as culturas em 1 ml de DM2 a 37 °C, 95% de humidade e 5% de CO2. Com uma pipeta, mudar 75% do meio em dias alternados, retirando três quartos do meio e substituindo-o por três quartos do meio fresco. Por exemplo, remova 750 μL de meio e adicione 750 μL de meio fresco.
3. Após 14 dias de cultivo, mudar para o meio DM3 (Tabela de Materiais) com 75% de troca do meio em dias alternados e por mais 16 dias.
4. Para manter os SFEBs nas inserções de cultura celular por mais de 30 dias, troque o meio em dias alternados por 60, 90 e 120 dias.
   nota: Os SFEBs crescerão até cerca de 1.000 μm de diâmetro e normalmente têm 100-150 μm de espessura.
5. Retire os SFEBs do inserto pipetando suavemente o meio usando uma ponta de pipeta de boca larga de 200 μL. Para transferir os SFEBs, use uma ponta de pipeta de boca larga para aspirar suavemente os corpos na ponta da pipeta. Depois de carregar o SFEB na ponta da pipeta, transfira suavemente para placas de 12 poços e lave com 300 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por poço.

Resultados

Figura 1: Linha do tempo das mudanças e fases médias durante o crescimento e expansão do SFEB.

Após a transferência dos SFEBs para as inserções, eles sofrem duas alterações de meio aos 14 e 28 dias in vitro (DIV). Eles são normalmente colhidos para experimentos em DIV 30, 60 e 90. As inserções superiores mostram diferentes fases neste processo. Barras ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de cultura de células de diferenciação neuronal SFEB. Reagentes. Componentes
Meio de Indução Neural STEMdiff (Mídia hiPSC)	Tecnologias STEMCELL	0-5835	250ml
Meio PluriQ ES-DMEM (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Componentes de mídia DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax líquido, 1:1	Invitrogen	10565018	385ml
Reposição de soro nocaute	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Caneta / estreptococos	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM 10 mM (100X), líquido	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	Invitrogen	21985023	900ul
Componentes de mídia DM2
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax líquido, 1:1	Invitrogen	10565018	500ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Caneta / estreptococos	Invitrogen	15140122	5ml
Suplemento N-2 (100X), líquido	Invitrogen	17502048	10ml
Componentes de mídia DM3
NEUROBASAL Médio (1X), líquido	Invitrogen	21103049	500ml
Suplemento B-27 Menos Vitamina A (50X), líquido	Invitrogen	12587010	10ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Caneta / estreptococos	Invitrogen	15140122	5ml
Componentes/Materiais
	Millicell	PICM0RG50
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL