Construindo circuitos neuronais padronizados em uma matriz de vários eletrodos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Kanner, S., et al. Design, Tratamento de Superfície, Revestimento Celular e Cultura de Redes Neuronais Modulares Compostas por Circuitos Funcionalmente Interconectados. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o processo de cultura de células neuronais em uma matriz de múltiplos eletrodos padronizada (MEA) para estabelecer redes neuronais modulares. Este método permite o estudo da transmissão de sinais neurais e interações celulares.

Protocolo

1. Preparação de matriz de múltiplos eletrodos (MEA)

Limpe o MEA nesta ordem (Tabela de Materiais):
1. Lave com água em água corrente e sonice em detergente enzimático concentrado 3 vezes.
2. Sonicar em água destilada 3 vezes.
3. Lave com água destilada (no copo, ponta de 1.000 μl) por 3 vezes e coloque sob ultravioleta (UV) por 30 min.
Apoio à preparação da rede:
1. Prepare o molde de rede de suporte projetado.
  1. Despeje o polidimetilsiloxano (PDMS) em uma placa de 12 poços (22 mm de diâmetro).
  2. Quando o PDMS estiver endurecido, remova o molde e, usando um bisturi, faça um furo no meio para criar uma forma de anel.
  3. Coloque um molde de rede de suporte projetado no centro do MEA (Figura 1A) e cubra o restante da superfície com poli-D-lisina (PDL) por 2 horas em temperatura ambiente (RT).
2. Remova o PDL usando uma pipeta e lave com água destilada.
3. Remova o molde e deixe secar (Figura 1A).
Alinhe o estêncil ao MEA da seguinte maneira:
1. Coloque o estêncil no micromanipulador designado. Use um microscópio invertido para alinhar com precisão a estrutura padronizada aos eletrodos e abaixe o estêncil até que ele seja colocado na superfície MEA (Figura 1B).
  nota: O contato com um MEA bem limpo fornece adesão competitiva entre o PDMS e o próprio MEA.
2. Levante o micromanipulador e, se necessário, use uma pinça para aplicar uma pequena quantidade de pressão acima do PDMS para evitar que ele se solte do MEA.
3. Pressione suavemente o estêncil na superfície MEA e use um microscópio para verificar se ele está firmemente preso e bem alinhado (Figura 1C-D).
Coloque MEA em uma câmara de vácuo por 15 min; coloque uma gota de 1 ml de PDL no estêncil.
Insira na câmara de vácuo 2 vezes por 20 min cada. Deixe o PDL secar O/N na incubadora.
Antes de revestir, remova os estênceis PDMS dos MEAs e lave-os com água estéril. Coloque sob iluminação UV por 7 min.

2. Chapeamento

Calcule o número de células necessárias para o plaqueamento usando um hemocitômetro
1. Certifique-se de que a câmara de contagem (hemocitômetro) esteja limpa e coloque uma lamínula sobre ela (use álcool para limpar).
2. Diluir 10 μl da suspensão celular em 190 μl de meio de plaqueamento (diluição 1:20).
3. Carregue 10 μl das células diluídas na borda da câmara de contagem e pipete lentamente as células para fora, permitindo que a câmara se encha.
4. Usando um microscópio invertido, visualize a grade do hemocitômetro. Determine o número de células na câmara por contagem direta (as células saudáveis devem ser redondas). Conte as células dentro do quadrado grande sem que elas cruzem as bordas.
5. Calcule a concentração de células:
  Número total de células/1000 μl = Total de células contadas × fator de diluição × 10⁴ (área do hemocitômetro).
  nota: Por exemplo, se o fator de diluição foi 20 e o total de células contadas foi 100:
  100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ células/1.000 μl ou 1 x 10⁶/100 μl. Para plaquear 0,75 x 10⁶ células, retire 75 μl das células.
Pegue o número de células necessárias para o revestimento por placa de MEA ou Petri, ressuspenda as células para evitar a agregação e coloque-as no centro, no topo da área padronizada (as células podem ser diluídas no meio, se necessário). Para o MEA, coloque uma gota de 100 μl no meio. Para a lamínula, coloque uma gota de 1.000 μl no meio.
Incubar as células plaqueadas a 37 °C durante 40 min. Adicionar meio de plaqueamento às células plaqueadas, até 1 ml por MEA e 2 ml por lamínula.
Manter a 37 °C e diluir com meio de crescimento fresco enriquecido com 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 e 0,75% de glutamax de 4 em 4 dias.
A partir de 6/7 DIV, depois de ver as conexões entre as ilhas, dilua o meio com 10 μl/ml de FUDR (25 mg de desoxiuridina + 62,5 mg de uridina em 12,5 ml de MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) ou qualquer outro agente antimitótico para evitar o crescimento excessivo da glia.

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Resultados

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Figura 1. Deposição de estruturas PDMS em um MEA. (A) Molde PDMS com formato de anel (marcado com a seta vermelha) montado em um MEA. O molde é usado para revestir a área destinada à rede neuronal de suporte e localizada na periferia da área de cultura (isso é limitado pelo anel montado no MEA e marcado pela seta verde). (B) Alinhamento de um estêncil PDMS no MEA usando um microma...