Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios motores funcionais

Resumo

Fonte: Garone, M. G., et al. Conversão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em neurônios motores espinhais e cranianos funcionais usando vetores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo mostra o processo de diferenciação de iPSCs humanas em neurônios motores. A lógica envolve a utilização de iPSCs que foram geneticamente modificadas para expressar fatores de transcrição específicos. Quando cultivado em um meio contendo doxiciclina, esse antibiótico desencadeia a expressão de fatores de transcrição, promovendo assim a diferenciação de iPSC em progenitores do neurônio motor. Em última análise, os progenitores são cultivados em um meio neuronal para produzir neurônios motores maduros e funcionais.

Protocolo

1. Manutenção de iPSCs humanas

1. Preparação de placas revestidas com matriz
   1. Descongele um frasco de 5 ml de matriz (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite. Os estoques matriciais originais vêm em diferentes concentrações de estoque, e as alíquotas são feitas de acordo com o fator de diluição indicado na folha de dados e são específicas para o lote individual. É crucial manter o frasco e os tubos gelados para evitar a gelificação prematura da matriz. Dispensar a matriz em alíquotas em criotubos pré-resfriados sobre gelo. Congelar as alíquotas não utilizadas a -20 °C.
   2. Coloque uma alíquota no gelo por cerca de 2 h para descongelar.
   3. Diluir a alíquota da matriz com 20 ml de DMEM/F12 frio num tubo cónico de 50 ml.
   4. Misture bem e dispense 1 mL de matriz diluída em placas de 35 mm (quantidades equivalentes por superfície de outras placas).
   5. Manter os pratos contendo matriz diluída por 1 h em temperatura ambiente para permitir o revestimento.
      nota: Os pratos, selados com parafilme, podem ser armazenados a 4 °C por até 2 semanas.
2. Preparação da solução-mãe (20 mL) e 1x alíquotas de trabalho do reagente de dissociação celular suave (ver Tabela de Materiais).
   1. Dissolver o pó a 10 mg/ml em PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺)
   2. Esterilize por filtro através de uma membrana filtrante de 0,22 μm.
   3. Preparar 20 alíquotas (1 ml cada) e conservá-las a -20 °C.
   4. Antes de usar, diluir uma alíquota em PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ livre) para 1 mg/mL (1x alíquotas de trabalho).
      NOTA: 1x alíquotas de trabalho podem ser armazenadas a 4 °C por 2 semanas.
3. Passagem de iPSCs humanos.
   1. Antes de começar: Se armazenado a 4 °C, pré-aqueça as placas revestidas com matriz na incubadora a 37 °C por 20-30 min. Pré-aqueça à temperatura ambiente a quantidade de meio iPSC humano (consulte a Tabela de Materiais) necessária. Pré-aqueça o DMEM/F12.
   2. Meio de cultura aspirado.
   3. Enxágue os iPSCs com PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   4. Adicione 1x solução de dissociação suave (0,5 mL para um prato de 35 mm). Incube a 37 °C até que as bordas das colônias comecem a se desprender da placa, geralmente 3-5 min.
   5. Aspirar a solução de dissociação suave, tomando cuidado para não separar as colônias de iPSC.
   6. Lave as células com DMEM/F12 (2 mL para uma placa de 35 mm) e aspire, tomando cuidado para não desprender as células. Repita esta etapa mais uma vez.
   7. Adicione o meio iPSC humano (1 mL para um prato de 35 mm).
   8. Separe suavemente as colônias com um levantador de células e transfira-as para um tubo de 15 mL.
   9. Quebre suavemente os aglomerados de células pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
   10. Aspirar o sobrenadante da(s) placa(s) revestida(s) de matriz.
   11. Semear as células no volume de cultura adequado do meio iPSC humano. A proporção de divisão pode variar de linha para linha e é de cerca de 1:4-1:8. Mude o meio diariamente.

2. Geração de linhas iPSC induzíveis por NIL e NIP

1. Transfecção celular
   1. Enxágue as células com PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Adicione o reagente de dissociação celular (consulte a Tabela de Materiais) (0,35 mL para um prato de 35 mm) e incube a 37 ° C até que as células individuais sejam separadas (5-10 min).
   3. Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
   4. Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ livre) a 10 mL. Conte as células.
   5. Pellet 10⁶ células e ressuspender em 100 μl de Buffer R (incluído no kit de eletroporação de células; consulte a Tabela de Materiais).
   6. Adicionar DNA plasmidial para transfecção: 4,5 μg de vetor transponível (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP12) e 0,5 μg do plasmídeo piggyBac transposase.
   7. Transfecto com o sistema de eletroporação de células (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante e conforme descrito anteriormente com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Semeie as células em um meio iPSC humano suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK, consulte Tabela de Materiais) em um prato revestido com matriz de 6 mm.
2. Seleção com antibióticos
   1. Dois dias após a transfecção, adicionar 5 μg/mL de blasticidina ao meio de cultura.
   2. A maioria das células não transfectadas morrerá dentro de 48 h após a seleção da blasticidina. Mantenha as células em blasticidina por pelo menos 7 a 10 dias para contra-selecionar as células que não integraram os transgenes no genoma.
   3. Manter células transfectadas de forma estável como uma população mista, composta de células com diferentes números de transgenes e diferentes locais de integração, ou isolar clones únicos.
   4. Prepare uma placa adicional para verificar a expressão efetiva dos transgenes após a indução de doxiciclina de 1 μg / mL por RT-PCR com primers específicos para transgenes para Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Reverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. Nesta fase, congelar as existências das novas linhas NIL e NIP-iPSC num meio de congelação para iPSC humanas (ver Quadro de Materiais).

3. Diferenciação do neurônio motor

1. Dissocie as células com o reagente de dissociação celular conforme descrito (etapas 2.1.1.-2.1.3.). Colete as células dissociadas em um tubo de 15 mL e dilua com 5 volumes de DMEM / F12. Pulverizar as células e ressuspender num meio iPSC humano suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK. Contar as células e semear em placas revestidas com matriz a uma densidade de 62.500 células/cm².
2. No dia seguinte, substitua o meio por DMEM/F12, suplementado com 1x análogo de L-glutamina estável, 1x suplemento de cultura de células de aminoácidos não essenciais (NEAA) e 0,5x penicilina/estreptomicina, contendo 1 μg/mL de doxiciclina. Este é considerado como o dia 0 da diferenciação. No dia 1, atualize o meio e a doxiciclina.
3. No dia 2, mude o meio para meio Neurobasal/B27 (meio neurobasal suplementado com 1x B27, 1x análogo de L-glutamina estável, 1x NEAA e 0,5x penicilina/estreptomicina), contendo 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 e 1 μg/mL de doxiciclina (ver Tabela de Materiais). Atualize o meio e a doxiciclina todos os dias até o dia 5.
4. Dia 5: Dissociação celular com reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais).
   1. Enxágue as células com PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Adicionar o reagente de dissociação celular (0,35 ml para uma placa de 35 mm) e incubar a 37 °C até que toda a monocamada celular se separe da placa.
      NOTA que as células individuais não serão separadas durante a incubação.
   3. Adicione 1 mL de DMEM/F12 e colete as células em um tubo de 15 mL.
   4. Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 10-15 vezes.
   5. Adicione 4 mL de DMEM/F12 e conte as células.
   6. Nesta fase, congele os progenitores do neurônio motor em um meio de congelamento celular (consulte a Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
   7. Pulverize as células e ressuspenda em meio neuronal (meio neurobasal / B27 suplementado com 20 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF e 200 ng / mL de ácido L-ascórbico, consulte a Tabela de Materiais) suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK.
   8. Semeie as células em poli-ornitina / laminina ou, alternativamente, em suportes revestidos com matriz a 100.000 células / cm² de densidade. Use suportes de plástico μ-Slide com lamínula de polímero (consulte a Tabela de Materiais) para análise de imunocoloração.
5. No dia 6, troque o meio para meio neuronal fresco desprovido de inibidor de ROCK. Nos dias seguintes, atualize metade do meio a cada 3 dias. O meio de cultura deve ser trocado com muito cuidado para evitar o desprendimento da superfície.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reagente de dissociação celular
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento sem soro para manutenção das células neuronais
Bambanker	Genética da Nippon	NGE-BB02	Meio de congelamento celular, usado aqui para progenitores de neurônios motores
BDNF	Tecnologia PreproTech	450-02	Fator neurotrófico derivado do cérebro
Blasticidina	Sigma-Aldrich	Rolamento 203350	Antibiótico nucleosídeo que inibe a síntese de proteínas em procariontes e eucariotos
Bsa	Sigma-Aldrich	A2153	Albumina de soro bovino. Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunomarcação
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Matriz qualificada para hESC da Corning Matrigel	Corning	354277	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
MEIO DE CONGELAMENTO ACF CRIOSTEM	Indústrias Biológicas	05-710-1E	Meio de congelamento para iPSCs humanas
D-glicose	Sigma-Aldrich	G5146	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inibidor da gama secretase
Exibir	Gibco	Rolamento 17105-041	Reagente para dissociação suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Meio basal para cultura de células
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Usado para induzir a expressão de transgenes dos vetores epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linha iPSC humana comercial
GDNF	Tecnologia PreproTech	450-10	Fator neurotrófico derivado da glia
Linha HiPSC Episómal Gibco	Thermo Fisher Científico	A18945	Linha iPSC humana comercial
Glutamamax	Thermo Fisher Científico	35050038	Uma alternativa à L-glutamina com maior estabilidade. Melhora a saúde celular.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Ácido L-ascórbico	Laboratórios LKT	Rolamento A7210	Usado em cultura de células como antioxidante
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
NEAA	Thermo Fisher Científico	11140035	Aminoácidos não essenciais. Usado como suplemento para meio de cultura celular, para aumentar o crescimento e a viabilidade celular.
Kit Neon 100 μL	Thermo Fisher Científico	MPK10096	Kit de eletroporação de células
Sistema de transfecção de néon	Thermo Fisher Científico	MPK5000	Sistema de eletroporação de células
Meio Neurobasal	Thermo Fisher Científico	21103049	Meio basal projetado para manutenção e maturação de longo prazo de populações de células neuronais sem a necessidade de uma camada alimentadora de astrócitos
NutriStem-XF/FF	Indústrias Biológicas	05-100-1A	Meio de cultura iPSC humano
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Tampão fosfato salino de Dulbecco, com cálcio, com magnésio
Livre de PBS Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampão de fosfato salino de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. 4333-100ML	Solução de penicilina/estreptomicina usada para prevenir a contaminação da cultura de células por bactérias.
poli-ornitina	Sigma-Aldrich	Pág. 4957	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inibidor seletivo do receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-2)
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol Usado para permeabilização celular em ensaios de imunocoloração
Y-27632 (inibidor de ROCK)	Enzo Ciências da Vida	ALX-270-333-M005	Inibidor seletivo permeável à célula da proteína quinase (ROCK) contendo bobina enrolada associada a Rho. Aumenta a sobrevivência do iPSC
μ-Slide 8 Poços	Ibidi	Rolamento 80826	Suporte para análise microscópica de ponta de células fixas