Gerando um modelo de co-cultura 3D de fibroblastos e neurônios da córnea humana

Resumo

Fonte: Sharif, R., et al. Engenharia de Tecidos da Córnea: Um Modelo In Vitro das Interações Estromal-Nervo da Córnea Humana. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar um sistema modelo de co-cultura tridimensional de fibroblastos primários da córnea humana e células neuronais diferenciadas. Este sistema de co-cultura pode ser usado para estudar as interações estromal-nervo.

Protocolo

1. HCFs primários (fibroblastos da córnea humana) Cultura e montagem de construções 3D

1. Montar construções 3D a partir de explantes previamente cultivados em EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico, passagem e contagem HCFs.
2. Semeie aproximadamente 1 x 10⁶ células/poço de HCFs primários em inserções de membrana de policarbonato com poros de 0,4 μm das construções 3D, juntamente com 1,5 mL de EMEM fresco 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico no topo da construção. Adicione mais 1,5 mL da mesma mídia na parte inferior de cada construção.
3. Após 24 h de semeadura celular, cultive as células com EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico, estimulado com 0,5 mM de ácido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C) adicionando 1,5 mL na parte superior e 1,5 mL na parte inferior de cada construção.
4. Manter as culturas numa incubadora a 37 °C, CO₂ a 5 % durante 3 semanas e fornecer meios frescos em dias alternados durante todo o período de estudo. Nenhuma outra passagem é necessária.

2. Diferenciação Celular e Co-culturas

1. Após 3 semanas, adicione 8 x 10³ células/poço de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y no topo das construções 3D previamente montadas contendo 1,5 mL do EMEM contendo 10% de FBS, 1% de antibiótico/antimicótico e 0,5 mM de ácido 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ascórbico (vitamina C).
   1. Permita que as células do neuroblastoma SH-SY5Y cresçam em cima das células estromais da córnea por pelo menos 24 horas antes de iniciar a diferenciação celular.
2. Inicie a diferenciação celular SH-SY5Y estimulando as células com EMEM contendo 1% de FBS e 1,5 mL de ácido retinóico 10 μM no topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ácido ascórbico (Vitamina C) na parte inferior da construção. Observe que a etapa do ácido retinóico deve ser realizada no escuro.
   1. Continue a cultivar as células neste meio de diferenciação por 5 dias.
3. Quando as células atingirem a fase de diferenciação, troque as células para 1,5 mL de meio sem soro contendo 2 nM de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1% de antibiótico/antimicótico adicionado ao EMEM, adicionando ao topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% Antibiótico/Antimicótico 0,5 mM 2-O-α-D-glucopiranosil-L-ácido ascórbico (Vitamina C) na parte inferior da construção. Observe que a etapa BDNF deve ser executada no escuro.
4. Cultive as células por mais 2 dias antes do processamento para qualquer análise adicional.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução tamponada com fosfato de Dulbecco (1X)	Gibco da Life Technologies	14190-144
Pinça estéril	Fischer Scientific	Telefone: 13-812-42	Pinça de Fragmentação de Ponta Extra-Fina Fisherbrand
Lâminas de barbear de borda única	Personna	Rolamento 270100
Lâminas de bisturi cirúrgico estéreis nº 10	Lâmina cirúrgica de penas	Nº 2976#10
Meio essencial mínimo de águia	ATCC	30-2003
Soro fetal bovino	Biológicos de Atlanta	S11550	10% de FBS é necessário para a preparação da mídia
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco da Life Technologies	15240-062	1% antibiótico-antimicótico é necessário para a preparação do meio
0,05% de tripsina EDTA (1X)	Gibco da Life Technologies	25300062
Inserções de membrana de policarbonato com poros de 0,4 μm	Corning Costar	3412
Ácido 2-O-α-Dglucopiranosil-L-ascórbico (Vitamina C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Deve ser utilizada uma concentração de 0,5 mM para o estudo
Células de neuroblastoma SH-SY5Y	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	A concentração final de 10uM precisa ser usada
BDNF	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	A concentração final de 2nM precisa ser usada
Dimetilsulfóxido (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	DMSO de grau ultrapuro estéril para ser usado
Thermo Scientific Nunc Cultura de Células Tratadas EasYFlasks (T25)	Fisher Científico	12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cultura de Células Tratadas EasYFlasks (T75)	Fisher Científico	12-565-349