Imunomarcação tecidual para citometria de massa por imagem

Resumo

O vídeo descreve a preparação de uma amostra de tecido para imagem de citometria de massa. O tecido é primeiro processado para desmascarar os epítopos do antígeno, permeabilizar as células e bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos. Em seguida, o tecido é incubado com um coquetel de anticorpos conjugado com metal e uma coloração nuclear. Finalmente, a amostra de tecido tratada é fotografada usando um scanner óptico.

Protocolo

1. Pré-tratamento do tecido:

Para lenços de papel frescos congelados:

1. Coloque um frasco de vidro Coplin no freezer a -20°C por pelo menos uma hora antes de usar.
2. Remova as lâminas do freezer a -80°C e coloque-as no frasco Coplin de vidro no freezer a -20°C por pelo menos 15 minutos.
3. Sob a hotte, use um cortador de ampola para abrir a ampola de vidro de paraformaldeído (PFA) a 16%. Descarte o vidro quebrado adequadamente.
4. Adicione 10 mL de PFA a 16% e 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a um frasco plástico Coplin. Certifique-se de que o PBS esteja pré-resfriado a 4°C.
5. Transfira esta solução para o frigorífico a 4°C durante pelo menos 15 minutos.
6. Após 15 minutos, transfira o frasco de vidro Coplin com as lâminas para a geladeira a 4°C por 10 minutos.
7. Transfira as lâminas do frasco de vidro para o frasco plástico Coplin contendo a solução fria de PFA a 4%.
8. Fixe as lâminas com 4% de PFA por 30 minutos dentro da geladeira.
9. Enxágue as lâminas três vezes em temperatura ambiente PBS por 5 minutos cada, garantindo um enxágue completo entre os ciclos.

Para tecidos FFPE:

1. Comece com as seções de tecido de 5 μm fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) montadas nas lâminas de microscópio padrão carregadas positivamente.
2. Desparafine as lâminas aquecendo-as a 60°C durante uma hora.
3. Remova as lâminas e resfrie-as até a temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos.
4. Coloque as lâminas em uma mala direta e enxágue-as em um banho de xileno por 3 minutos, duas vezes.
5. Novamente, enxágue as lâminas com etanol 100% por 1 minuto, duas vezes.
6. Da mesma forma, enxágue as lâminas em etanol a 95% e 70% por 1 minuto cada.
7. Por fim, faça um enxágue final duas vezes em água destilada por 3 minutos.
   nota: O Hyperion não pode fazer ablação a menos de 2 mm da borda deslizante, centralizar o tecido o máximo possível.

2. Recuperação de epítopos induzida por calor (HIER)

1. Preparar o tampão pH9 do ácido tris-etilenodiaminotetracético (EDTA):
   1. O tampão Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER é adquirido a 100x e diluído a 1x em água de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
   2. Ex: 2,5 mL Abcam ab93684 em 247,5 mL de água HPLC.
      nota: Tampão com mais de seis meses não deve ser usado.
2. Configure uma câmara de descamuflagem para aquecer as lâminas. Primeiro, encha o fundo da câmara com 500 mL de água da torneira. Em seguida, adicione 250 mL de água da torneira em ambos os recipientes laterais e 200 mL de água da torneira no recipiente central.
3. Coloque até 3 slides em um envelope de 5 lugares.
4. Encha o envelope de slides com o tampão HIER até que o tecido esteja completamente submerso. nota: Certifique-se de que o envelope deslizante tenha um pequeno orifício na parte superior para liberar o vapor e evitar a pressurização.
5. Execute o "Programa 4" por 20 minutos a 95 °C.
6. Enquanto isso, pré-aqueça as câmaras de incubação para as etapas subsequentes (consulte a etapa 3.5)
7. Após a incubação, retire o envelope e coloque-o em uma banheira com água fria da torneira.
8. Deixe esfriar por 5 minutos.
9. Remova metade do tampão da mala direta e substitua-o por água destilada. Deixe esfriar por 5 minutos.
10. Remova gradualmente o tampão e aumente o volume de água duas vezes, cada uma com um período de resfriamento de 5 minutos.
11. Por fim, enxágue as lâminas em água 100% destilada.

3. Bloqueando a ligação não específica

1. Prepare o tampão de bloqueio (solução salina tamponada com Tris ou TBS, Triton X-100 a 0,1%, albumina de soro bovino a 3% ou BSA) adicionando 150uL de TBS com 10% de BSA a 350uL de TBS com Triton X-10.
   nota: A TBS com 10% de BSA é armazenada a -20 °C e deve ser descongelada fresca a cada vez.
2. Usando uma mala direta de slides ou frascos Coplin, lave as lâminas por 5 minutos em TBS, 0,1% Triton X-100 duas vezes.
3. Remova o slide da mala direta e use um lenço Kim para remover qualquer buffer fora do círculo PAP. Deixe ~ 1 minuto secar ligeiramente.
4. Usando um P200, adicione algumas gotas do tampão de bloqueio sobre o tecido, apenas o suficiente para cobri-lo. A linha PAP deve manter o líquido sobre o tecido.
   nota: Se o tampão não estiver confinado no círculo PAP, redesenhe o círculo PAP ao redor do tecido para evitar a perda de anticorpos posteriormente.
5. Incubar a lâmina à temperatura ambiente numa câmara de humidade durante 1 hora.
   nota: Uma caixa de ponteira de pipeta vazia funciona bem para uma câmara de umidade. Certifique-se de que uma pequena quantidade de água da torneira esteja presente no fundo.

4. Coloração com anticorpos conjugados com metal

1. Remova os anticorpos conjugados com metal de 4 ° C e centrifugue a 10.000 x G por 1 minuto.
2. Preparação da diluição ideal da mistura mestre de anticorpos em TBS, Triton X-100 a 0,1% e mistura BSA a 1%
   NOTA: a) A diluição ideal de cada anticorpo deve ser determinada experimentalmente e é uma das etapas mais críticas para experimentos bem-sucedidos de citometria de massa por imagem. Use uma planilha do Excel para calcular volumes. Faça apenas um pouco mais do que o necessário devido ao custo do anticorpo. por exemplo, se foram necessários 200 uL de buffer de bloqueio, faça um master mix de 250uL. b) A mistura principal deve ser preparada fresca para cada experimento durante a etapa de bloqueio.
3. Após a incubação (consulte a etapa 3.5), remova a lâmina da incubadora.
4. Remova o excesso de buffer de bloqueio tocando no slide vertical e horizontalmente nos lenços umedecidos. Isso deve deixar algum tampão de bloqueio no tecido, mas removerá a maior parte dele.
5. Deixe ~ 1 minuto secar ligeiramente.
6. Coloque o slide na câmara de umidade a 4°C e deixe-o equilibrar.
7. Em seguida, pipete cuidadosamente a mistura principal de anticorpos no tecido, extremamente cuidadosa para que a solução esteja contida dentro do círculo PAP.
8. Feche a câmara de umidade e incube durante a noite a 4°C.
9. Após a incubação durante a noite, remova a lâmina de 4 ° C e remova o excesso de mistura principal batendo na lâmina vertical e horizontalmente nos lenços Kim.
10. Coloque a lâmina no envelope ou no frasco de Coplin; lave por 5 minutos com solução salina tamponada com fosfato ou PBS, suplementado com 0,2% de Triton X-100, duas vezes.
11. Em seguida, lave a lâmina em PBS por 5 minutos, duas vezes. Remova a lâmina e deixe-a secar por aproximadamente 1 minuto.

5. Intercalação de DNA

1. Para intercalação de DNA, diluir o intercalator-Ir 1:1000 em PBS.
2. Pipete cuidadosamente o intercalador diluído no tecido, tomando muito cuidado para que a solução fique contida no círculo PAP.
3. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente na câmara de humidade utilizada para o bloqueio.
4. Depois disso, toque nos slides vertical e horizontalmente nos lenços umedecidos Kim para remover o excesso de corante Intercalator-Ir.
5. Coloque a lâmina na mala direta ou no frasco Coplin e lave duas vezes com água HPLC por 5 minutos cada.
6. Seque as lâminas em um dessecador por 5 minutos antes de digitalizar.

6. Digitalização de imagens

1. Para digitalização de slides, use um gravador de vidro com ponta de carboneto para riscar quatro Xs fracos no slide. Pontos de ensino precisos permitirão o melhor registro de imagem.
   nota: Não chegue muito perto da borda.
2. Digitalize usando um scanner de documentos de mesa a pelo menos 1200 pontos por polegada
3. Corte esta imagem o mais próximo possível das bordas do slide e salve-a em uma unidade flash.
4. Para o co-registro de imagem, digitalize o slide em um Hamamatsu NanoZoomer com "Pre_IMC" no nome do arquivo.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática do procedimento de imunomarcação tecidual para citometria de massa por imagem

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamentos
Frascos de Coplin
Envelope de plástico 5 slides com orifício de ventilação
Dispositivo de recuperação de antigénios (câmara de camuflagem)
scanner
Produtos químicos e enzimas:
xileno
Etanol de 200 provas
Água HPLC
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer
Tbs
TBS com 0,1% Trition X-100
TBS com 10% BSA
Pbs
PBS com 0,2% Trition X-100