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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação da fatia
- Construa ou obtenha uma câmara de recuperação de fatias.
NOTA: O princípio de uma câmara de recuperação é simples e pode ser feito em laboratório (Figura 1). Resumidamente, a câmara é um receptáculo no qual uma cesta é inserida para manter as fatias do cérebro em um nível inferior à superfície do líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF).
- Como exemplo, obtenha quatro anéis (4 - 6 mm de altura) (Figura 1A, vista lateral; B, vista superior) cortando uma seringa de 30 cc. Em seguida, cole redes esticadas (por exemplo, cortadas de uma mangueira de náilon) em um lado dos anéis para segurar as fatias de cérebro (Figura 1B) e cole os anéis.
NOTA: Uma pistola de cola pode ser usada.
- Depois que os quatro anéis estiverem colados, cole uma parede de plástico isósceles curva em forma de trapézio em dois dos anéis (Figura 1A e B) para desviar as bolhas de oxigênio das fatias cerebrais em recuperação (Figura 1C e D). Conforme mostrado na Figura 1D, insira um sistema de difusão de oxigênio (aqui, um tubo de dispersão de gás) no mesmo lado das paredes de plástico.
- Antes de cortar, oxigenar (95% O2/5% CO2) e arrefecer a solução de fatiar (ver passo 1.4) a 0 - 2 °C.
- Encha a câmara de recuperação personalizada com aCSF padrão à temperatura ambiente (RT). Certifique-se de que o aCSF esteja bem oxigenado (20 - 30 min, o tempo pode variar de acordo com o volume da câmara) antes de colocar as fatias na câmara de recuperação. Certifique-se de que as bolhas de gás não entrem em contato direto com as fatias ou as interrompam.
- Forre a bandeja de gelo do vibratomo com gelo e encha-a com água fria para que um terço a metade da câmara de corte fique submersa. Coloque cuidadosamente um sistema de fornecimento de oxigênio (por exemplo, pedra difusora de gás) e uma sonda de temperatura na câmara de corte para que nenhum item interfira no movimento da lâmina ou na manipulação do corte.
- Prepare a área de dissecação e as ferramentas necessárias para extrair o cérebro e dissecar a região cerebral desejada.
NOTA: A dissecção exata realizada dependerá da região cerebral específica estudada, pois diferentes estruturas cerebrais exigirão cortes em diferentes planos (por exemplo, cortes coronais, sagitais ou horizontais).
- Coloque as seguintes ferramentas em uma almofada: tesoura de decapitação, bisturi, tesoura pequena de ponta reta e afiada, pinça de canulação de vaso (ou qualquer ferramenta cirúrgica com ponta larga, como rongeurs, que é mais adequada para crânios de ratos), pinça hemostática curva, pinça, espátula, espátula, papel de filtro, placa de Petri, lâmina de barbear de ponta única e cola de cianoacrilato.
- Quando a temperatura atingir 0-2°C, transfira a solução de fatiamento para a câmara de fatiamento (bandeja tampão).
- Anestesiar o camundongo em uma câmara de dessecação usando isoflurano. A quantidade exata pode variar de acordo com o tamanho da câmara usada, mas para uma gaiola de caixa de sapatos pequena, use algumas gotas (~3-4). Deixe o mouse na gaiola até ficar imóvel (não respondendo a estímulos táteis; cerca de 15 segundos para as condições descritas aqui). Realize testes de pinça de cauda e pé para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado e, em seguida, decapite antes que o coração pare de bater (aumenta a viabilidade celular).
NOTA: Com a devida justificativa, alguns laboratórios obtêm a autorização para realizar a decapitação ao vivo, a fim de minimizar ao máximo os processos excitotóxicos e aumentar a viabilidade celular.
- Realize a dissecção.
NOTA: O cérebro deve ser extraído rapidamente (<45 seg).
- Usando o bisturi, corte a pele superficial no topo do crânio de rostral para caudal.
- Descasque o couro cabeludo de cada lado da cabeça.
- Usando uma tesoura pequena de ponta reta e afiada, corte a placa interparietal ao longo da sutura lambdoide para remover o cerebelo. Remova o osso occipital.
- Usando a mesma tesoura, corte a sutura sagital.
- Deslize a pinça de canulação do vaso (ou rongeurs se quebrar o crânio de um rato) abaixo de cada osso parietal e puxe para expor o cérebro.
- Usando a pinça hemostática curva, aperte os ossos frontais para quebrá-los e, em seguida, use uma pinça ou pinça de canulação do vaso para remover os ossos quebrados. Corte e remova a dura-máter o mais suavemente possível, pois pode interferir na dissecção.
- Deslize a espátula abaixo do cérebro e puxe-a suavemente para fora do crânio. Coloque-o na câmara de fatiar (bandeja tampão) previamente cheia de aCSF gelado. Deixe o cérebro esfriar por 1-2 min.
- Prepare a plataforma de dissecação enchendo uma placa de Petri com gelo e um pouco de água gelada para permitir um maior contato com a superfície. Cubra o prato com a tampa e coloque papel de filtro por cima. Molhe o papel de filtro com aCSF frio.
- Assim que o cérebro esfriar, coloque-o na placa de Petri cheia de gelo e execute rapidamente a dissecção apropriada para obter o plano de corte desejado.
- Para obter fatias sagitais contendo o núcleo accumbens (NAc), use uma lâmina de barbear de ponta única para cortar e remover os tubérculos olfatórios e o cerebelo, se ainda estiverem presentes. Em seguida, faça um corte sagital de 2-3 mm a partir da borda lateral do hemisfério direito para obter a superfície plana que será colada na placa de suporte da amostra (ver passo 1.8.11).
NOTA: Cortar apenas 2 a 3 mm da borda lateral do hemisfério permitirá a coleta de fatias contendo o NAc de ambos os hemisférios. A dissecção apropriada dependerá da região do cérebro investigada. Aqui, a dissecção é realizada para que os neurônios NAc possam ser registrados em fatias cerebrais sagitais.
- Cole rapidamente (usando cola de cianoacrilato aplicada à placa de suporte da amostra) a superfície plana de corte do cérebro na placa de acordo com o plano de corte desejado. Para obter fatias cerebrais sagitais, consulte a etapa 1.8.10.
- Coloque e prenda imediatamente a placa de suporte da amostra na câmara de corte para que o cérebro seja cortado rostro-caudalmente (por segurança, configure o porta-lâmina somente quando a placa da amostra estiver presa).
- Defina o vibratomo com parâmetros de fatiamento apropriados (parâmetros usados no laboratório para o vibratomo mencionados em Materiais: velocidade 3 - 4, vibração 9-10 e espessura de corte 250 μm).
- Ao fatiar, use uma pipeta de transferência com acabamento em plástico para transferir os cortes de cérebro para a câmara de recuperação (em RT) (consulte a etapa 1.3). O tempo de recuperação pode variar dependendo do tipo neuronal que está em estudo (normalmente 30 - 90 min).
2. Gravação de micropipetas e preparação de equipamentos
- Consulte as diretrizes específicas do manual do usuário do extrator para obter as propriedades desejadas da micropipeta.
NOTA: Para MSNs, usamos uma faixa de resistência de pipeta de 3,2-4,0 MΩ.
- Oxigenar o aCSF e ajustar o fluxo para 2 ml/min. Aspirar o aCSF usando uma bomba peristáltica ou linhas de vácuo instaladas na instalação.
- Ligue o controlador do aquecedor de perfusão e ajuste as configurações de temperatura para obter a temperatura desejada (por exemplo, 31.8-32.2 °C).
NOTA: A estabilidade da temperatura depende de ter um nível constante de aCSF e uma velocidade de fluxo constante na câmara. Uma vez que várias propriedades biofísicas dos neurônios (por exemplo, resistência de entrada, Ri, também chamada de resistência de membrana, Rm) são sensíveis à temperatura, é importante manter uma temperatura estável.
- Ligue o amplificador controlado por computador, a câmera, o micromanipulador e a luz de fundo do microscópio. Se estiver realizando um experimento que exija estimulação elétrica do tecido, ligue o controlador de estímulo e a unidade de isolamento.
NOTA: Alguns amplifiers de outros fabricantes recomendam um "aquecimento" antes do uso, por isso é recomendável consultar o manual para o procedimento operacional exato.
- Inicie a captura da câmera, aquisição de sinal e software amplificador.
- Posicionamento e visualização de fatias:
- Usando uma pipeta de transferência de ponta aparada de plástico, retire suavemente uma fatia de cérebro da câmara de recuperação.
- Coloque a pipeta de transferência na câmara de registro e esprema suavemente a fatia da pipeta na lamínula que reveste o fundo da câmara.
NOTA: Desde que não ocorra transbordamento, é inofensivo ter um pouco de aCSF da câmara de recuperação derramando no banho.
- Use uma pinça para alterar a posição da fatia para que a área desejada seja colocada exatamente no centro da câmara de gravação. Use a lente objetiva de baixa potência (4X) do microscópio e a ocular para auxiliar no posicionamento.
- Depois que a posição desejada for alcançada, prenda a posição do corte do cérebro com uma retenção de corte (também conhecida como "harpa") na câmara.
- Mude para uma lente objetiva de alta potência (40X) e abaixe-a suavemente até formar contato com o aCSF na câmara.
- Use a roda de ajuste fino para colocar o tecido em foco. Enquanto estiver em contato com o aCSF, não use a roda de ajuste grosseiro no microscópio, pois abaixar excessivamente a lente objetiva pode esmagar a fatia ou até mesmo quebrar a lamínula que reveste o fundo da câmara, o que pode fazer com que o aCSF derrame no condensador e danifice-o.
- Quando o foco estiver no nível do tecido, observe as células na região alvo quanto à forma. As células mortas são facilmente identificáveis por sua membrana plasmática e núcleo inchados (Figura 1E). As células saudáveis devem aparecer como estruturas homogêneas redondas, ovóides ou elípticas (Figura 1E).
- Procure uma célula de destino. Marque-o na tela do computador para ajudar a guiar a micropipeta de gravação. Se estiver usando um software como o QCapture, desenhe um quadrado ao redor da célula de destino segurando o botão esquerdo do mouse.
- Levante a lente objetiva para que haja espaço suficiente no cone formado pela lente objetiva em contato com o aCSF para colocar e mover a micropipeta de gravação.
- Colocação e posicionamento de micropipetas
- Usando uma seringa de 1 ml, uma agulha de microsseringa não metálica e um filtro dedicado, encha uma micropipeta com a solução interna preparada previamente de acordo com o experimento planejado (solução interna à base de K+ ou Cs+, consulte Materiais para composição). Use solução suficiente para que a solução interna entre em contato com o eletrodo de fio de prata revestido com cloreto dentro do suporte da micropipeta.
NOTA: O eletrodo de fio de prata pode ser clorado mergulhando-o em alvejante doméstico. Trifosfatos de nucleosídeos (trifosfato de adenosina, ATP e trifosfato de guanosina, GTP) podem ser adicionados à solução interna antes do uso. Mantenha a seringa contendo a solução congelada para evitar a degradação do ATP/GTP.
- Certifique-se de que não haja bolhas de ar na micropipeta, pois elas podem sair enquanto a micropipeta está no tecido e obscurecer a fatia.
- Coloque a micropipeta no porta-eletrodo de forma que a solução entre em contato com o eletrodo de fio revestido de cloreto de prata.
- Aperte a tampa da pipeta para que a arruela cônica forme uma vedação ao redor da micropipeta.
- Aplique pressão positiva antes de imergir a micropipeta no aCSF para evitar que detritos entrem na pipeta.
- Coloque o cabeceira stage na posição travada (de frente para a câmara) e, usando o micromanipulador, guie-o para baixo em direção à câmara de modo que fique aproximadamente abaixo do centro da objetiva imersa.
- Enquanto move a micropipeta com o micromanipulador (ajustado em velocidade média a alta), use a tela do computador para localizar a micropipeta e guiá-la em direção à localização da célula no eixo XY.
- Meça a resistência da micropipeta aplicando um passo de tensão (por exemplo, 4 mV para 100 ms), que pode ser realizado manualmente ou automaticamente por meio de software específico, como o modo 'banho', se estiver usando "Teste de membrana" no software Clampex (consulte também a etapa 4). Para garantir que nenhuma bolha de ar ou qualquer outro objeto estranho bloqueie a micropipeta, aplique pressão positiva usando a seringa cheia de ar (por exemplo, seringa de 30 cc) conectada ao porta-micropipeta com tubo de polietileno.
- Depois de limpar a micropipeta, execute um deslocamento de tensão para reduzir a corrente da pipeta a zero, o que pode ser realizado manualmente ou por meio de um software específico, como 'deslocamento da pipeta' no comando do amplificador controlado por computador.
NOTA: Esta função compensará qualquer voltage causado por diferenças de concentração entre o banho e as soluções de micropipeta (ou seja, potencial de junção de líquido).
3. Teste de membrana
NOTA: Esta etapa se aplica ao amplifier mencionado nos Materiais.
- Ao usar um comando de amplificador controlado por computador, sempre coloque-o no modo de grampo de tensão para realizar o teste de membrana.
NOTA: Quando o teste de membrana é definido no modo "Banho", o teste de membrana permite a medição da resistência da micropipeta e da resistência da vedação quando a vedação é formada.
- Uma vez que a membrana é rompida (consulte a etapa 4.8), mude o teste de membrana para o modo "Célula" para que a resistência em série (Rs) (também chamada de resistência de acesso, Ra), Ri e capacitância da membrana (Cp) possam ser obtidas.
4. Aproximação Final, Formação de Selo e Obtenção da Configuração de Célula Inteira
- Usando a roda de foco fino, comece a focar enquanto abaixa a micropipeta gradualmente. Sempre foque primeiro e depois abaixe a micropipeta até o plano de foco. Isso garantirá que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia.
- Quando a micropipeta entrar em contato com a superfície da fatia, diminua a velocidade do micromanipulador para o modo médio-baixo.
- Aplique suavemente uma leve pressão positiva com a seringa cheia de ar conectada ao porta-pipetas para limpar quaisquer detritos do caminho de aproximação.
- Aproxime-se da célula alternando com os botões de controle XYZ ou aproximando-se diagonalmente (se o modelo do micromanipulador permitir), onde ambos os eixos XZ são alterados com a rotação do botão do eixo Z. O último método evitará a compressão vertical do tecido.
NOTA: Aqui, o objetivo é se aproximar da célula infligindo danos mínimos à fatia. Quando a micropipeta está perto o suficiente da célula, aparece uma covinha (uma descoloração redonda da superfície celular causada pela pressão positiva aplicada através da ponta da micropipeta) (Figura 2).
- Quando a covinha aparecer (Figura 2-1), aplique uma sucção fraca e breve através do tubo que está conectado ao tubo de sucção do porta-pipetas para criar a vedação (Figura 2-2). Continue monitorando o teste de membrana.
NOTA: Se uma vedação parcial for formada (<1 GΩ), injetar correntes negativas diminuindo o potencial de retenção (no comando do amplificador controlado por computador) pode facilitar a formação da vedação e atingir a resistência de gigaohms ("vedação gigaohm" ou "gigaseal" >1 - 5 GΩ). A alta resistência da vedação (>1 GΩ) limitará a contaminação por ruído ao sinal gravado e contribuirá para a estabilidade mecânica do remendo.
- Enquanto um gigaseal está se formando, use o comandante do amplificador controlado por computador para trazer o potencial de retenção da célula o mais próximo possível do potencial fisiológico de repouso (repouso em V), a fim de evitar mudanças repentinas quando a membrana for rompida. Por exemplo, os MSNs geralmente são fixados por voltagem em -70 ou -80 mV (repouso V fisiológico: -70 a -90 mV).
- Após a formação do gigaseal, compense a capacitância rápida e lenta manualmente ou automaticamente. Se estiver usando um comando de amplificador controlado por computador, como o controlador Multiclamp, pressione 'Auto' para 'Cp Fast' e 'Cp Slow".
- Se a vedação permanecer estável e acima de 1 GΩ (ou injetando menos de 10 - 20 pA para manter a célula no potencial de membrana desejado), aplique uma sucção breve e forte através do mesmo tubo que em 4.5 para romper a membrana plasmática (Figura 2-3).
NOTA: Isso pode levar várias tentativas. Uma boa ruptura da membrana é alcançada quando a sucção é realizada com força suficiente para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta (o que pode levar a um aumento de Rs durante a gravação), mas fraca o suficiente para não atrair uma grande porção da membrana ou da célula.
- Depois de obter uma configuração bem-sucedida de toda a célula, monitore regularmente a localização da micropipeta para avaliar e corrigir desvios significativos, pois isso pode levar à perda do adesivo. A amplitude de deriva pode variar de acordo com vários fatores, por exemplo, a qualidade da instalação da plataforma e as forças de tração no headstage. Idealmente, a deriva deve ser quase inexistente.
- Ao alternar para o modo "Célula" no teste de membrana, visualize diferentes parâmetros da célula, comoR i,Rs e CP. Monitore esses parâmetros durante a gravação.
NOTA: Todos esses parâmetros podem ajudar a avaliar o estado de saúde inicial das células e tipos de células (consulte a seção "Teste de membrana", etapa 4).
