1. Diferenciação de hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 em neurônios em MEAs de 6 poços e lamínulas de vidro
NOTA: Neste protocolo, são fornecidos os detalhes para diferenciar hiPSCs positivos para transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA)/Neurogenina-2 (Ngn2) em MEAs de 6 poços (dispositivos compostos por 6 poços independentes com 9 microeletrodos embutidos de gravação e 1 de referência por poço).
- Preparar os MEAs (dia 0 e dia 1)
- No dia anterior ao início da diferenciação, esterilize os MEAs de acordo com a recomendação do fabricante.
- Diluir a proteína de adesão Poli-L-Ornitina (OLP) em água ultrapura estéril até uma concentração final de 50 μg/ml. Cubra a área do eletrodo ativo de MEAs de 6 poços colocando uma gota de 100 μL do PLO diluído em cada poço.
- Incube os MEAs de 6 poços durante a noite (O/N) em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2. No dia seguinte, aspire o OLP diluído. Lave as superfícies de vidro dos MEAs de 6 poços duas vezes com água ultrapura estéril.
- Diluir a laminina na mistura de meio/nutriente Eagle modificada F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco frio até uma concentração final de 20 μg/mL. Cubra imediatamente a área do eletrodo ativo dos MEAs de 6 poços, colocando uma gota de 100 μL em cada poço.
- Incube os MEAs de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2 por pelo menos 2 h.
- Placa os hiPSCs (dia 1)
NOTA: Os volumes mencionados nas etapas 1.2.1 a 1.2.4 assumem que os hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 são cultivados em uma placa de 6 poços e que as células de um poço são colhidas. Os volumes necessários para o revestimento das células nos MEAs de 6 poços dependem do número de MEAs de 6 poços usados no experimento; Os números especificados nas etapas 1.2.6 a 1.2.8 permitem o dimensionamento para diferentes tamanhos de experimento.
- Aqueça DMEM / F12, solução de descolamento celular (CDS) e meio E8 com penicilina / estreptomicina a 1% (v / v) a R / T. Adicione doxiciclina a uma concentração final de 4 μg / mL e inibidor da proteína quinase associada a rho (ROCK) ao meio E8.
- Aspire o meio gasto dos hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 e adicione 1 mL de CDS aos hiPSCs. Incubar 3 - 5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2. Verifique ao microscópio se as células estão se desprendendo umas das outras.
- Adicione 2 mL de DMEM/F12 no poço, suspenda suavemente as células com uma pipeta de 1.000 μL e transfira as células para um tubo de 15 mL. Adicione 7 mL de DMEM/F12 à suspensão celular. Gire as células a 200 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 ml do meio E8 preparado. Dissocie as hiPSCs colocando a ponta de uma pipeta de 1.000 μL contra a lateral do tubo de 15 mL e ressuspendendo as células suavemente. Verifique ao microscópio se as células estão dissociadas.
- Determine o número de células (células/mL) usando uma câmara de hemocitômetro.
NOTA: Um poço de placa de 6 poços com 80 - 90% de confluência normalmente produzirá 3,0 - 4,0 x 106 células no total.
- Aspirar a laminina diluída. Para os MEAs de 6 poços, dilua as células para obter uma suspensão celular de 7,5 x 105 células/mL. Plaquear as células adicionando uma gota de 100 μL da suspensão celular na área do eletrodo ativo em cada poço dos MEAs de 6 poços.
- Coloque os MEAs de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2 por 2 h.
- Após 2 h, adicione cuidadosamente 500 μL do meio E8 preparado a cada poço dos MEAs de 6 poços. Coloque os MEAs O/N de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Alterar o meio (dia 2)
- No dia seguinte, prepare DMEM/F12 com suplemento N-2 a 1% (v/v), aminoácidos não essenciais a 1% (v/v) e penicilina/estreptomicina a 1% (v/v). Adicione neurotrofina-3 recombinante humana (NT-3) a uma concentração final de 10 ng/mL, fator neurotrófico derivado do cérebro recombinante humano (BDNF) a uma concentração final de 10 ng/mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg/mL. Aquecer o médio a 37 °C.
- Adicione laminina a uma concentração final de 0,2 μg / mL ao meio. Filtre o meio resultante. Aspire o meio gasto dos poços dos MEAs de 6 poços e da placa de 24 poços e substitua-o pelo meio preparado. Incube os MEAs O/N de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Adicionar astrócitos de rato (dia 3)
NOTA: Os volumes mencionados neste protocolo assumem que os astrócitos de ratos são cultivados em frascos de cultura T75. É fundamental que os astrócitos de ratos adicionados às culturas sejam de boa qualidade. Usamos dois critérios para verificar se os astrócitos de ratos são de boa qualidade. Primeiro, a cultura de astrócitos de ratos deve ser capaz de crescer confluente dentro de dez dias após o isolamento dos cérebros embrionários de ratos. Em segundo lugar, depois de dividir a cultura de astrócitos de ratos, os astrócitos de ratos devem ser capazes de formar uma monocamada confluente e tesselada. Se a cultura de astrócitos de ratos não atender a esses dois critérios, aconselhamos não usar essa cultura para experimentos de diferenciação.
- Aqueça o ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,05% em RT. Aqueça a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e DMEM / F12 com penicilina / estreptomicina a 1% (v / v) a 37 ° C.
- Aspire o meio gasto da cultura de astrócitos de ratos. Lave a cultura adicionando 5 mL de DPBS e agite-a suavemente.
- Aspire o DPBS e adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%. Agite a tripsina-EDTA suavemente. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 a 10 min.
- Verifique ao microscópio se as células estão separadas. Separe as últimas células batendo no frasco algumas vezes.
- Adicionar 5 ml de DMEM/F12 ao balão. Triturar as células suavemente dentro do frasco com uma pipeta de 10 mL. Recolha a suspensão celular num tubo de 15 ml. Gire o tubo a 200 x g por 8 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM/F12. Determine o número de células (células/mL) usando uma câmara de hemocitômetro.
- Adicione 7,5 x 104 astrócitos por poço dos MEAs de 6 poços. Incube os MEAs O / N em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Alterar o meio (dia 4)
- Prepare o meio neurobasal com 2% (v / v) de suplemento de B-27, 1% (v / v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicione NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg / mL. Além disso, adicione citosina β-D-arabinofuranosídeo a uma concentração de 2 μM.
NOTA: A citosina β-D-arabinofuranosídeo é adicionada ao meio para inibir a proliferação de astrócitos e matar os hiPSCs restantes que não estão se diferenciando em neurônios.
- Filtrar o meio e aquecer a 37 °C. Aspirar o meio gasto dos alvéolos dos MEAs de 6 poços e substituí-lo pelo meio preparado. Mantenha os MEAs de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Atualize o meio (dia 6 a 28)
NOTA: A partir do dia 6, atualize metade do meio a cada dois dias. A partir do dia 10, o meio é suplementado com soro fetal bovino (FBS) para apoiar a viabilidade dos astrócitos.
- Prepare o meio neurobasal com 2% (v / v) de suplemento de B-27, 1% (v / v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicione NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg / mL. A partir do dia 10, suplementar também o meio com 2,5% (v/v) de FBS. Filtrar o meio resultante e aquecer a 37 °C.
- Remova metade do meio gasto dos poços dos MEAs de 6 poços usando uma pipeta de 1000 μL e substitua-o pelo meio preparado. Mantenha os MEAs de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2.
2. Estabelecer o perfil neurofisiológico de neurônios derivados de hiPSC
NOTA: Duas a três semanas após a indução da diferenciação, os neurônios derivados do hiPSC podem ser usados para diferentes análises a jusante. Nesta seção, são dados exemplos de algumas análises a jusante que podem ser realizadas para estabelecer o perfil neurofisiológico dos neurônios derivados do hiPSC.
- Caracterizar a atividade da rede neuronal usando MEAs
- Registre 20 minutos de atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de hiPSC cultivados em MEAs. Durante o registo, manter a temperatura a 37 °C e evitar a evaporação e as alterações de pH do meio através da insuflação de um fluxo constante e lento de gás humidificado (5% CO2, 20% O2, 75% N2) sobre o MEA.
- Após 1200X amplificação (MEA 1060, MCS), faça uma amostragem do sinal a 10 kHz usando a placa de aquisição de dados MCS. Analise os dados (detecção de pico e explosão) usando um pacote de software personalizado.
