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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação das Soluções
- O líquido cefalorraquidiano artificial padrão (ACSF; Tabela 1)
- Use sais de alta pureza e copos de vidro limpos previamente enxaguados com água bidestilada para preparar uma solução fresca. Use água bidestilada de alta qualidade para a preparação de todas as soluções extracelulares e intracelulares.
- De acordo com a Tabela 1, pegue um béquer de 2 L para dissolver o NaHCO3 em 500 mL de água e outro para dissolver os outros sais para evitar a precipitação de íons divalentes. Limpe a espátula sistematicamente com água bidestilada e seque-a antes de tomar um sal. Use um agitador magnético para homogeneizar a dissolução. Adicionar as soluções de ambos os copos a um balão volumétrico adequado e levá-las ao volume adequado.
- Certifique-se de que a solução extracelular final seja totalmente transparente e sem qualquer vestígio de precipitação.
- Aplicar uma mistura gasosa composta por 95% de O2 e 5% de CO2 (gás carbogénio) com uma vela de microfiltro de vidro (Ø 13 mm) 20 - 30 min antes de perfundir as fatias. Controle cuidadosamente a osmolaridade (2 - 3 medições consecutivas) do ACSF com um osmômetro (faixa ideal: 314 - 325 mOsmol / L). Conservar a solução restante após a preparação a 4 °C e utilizá-la no prazo de 3 dias.
- Solução de corte (sacarose-ACSF; Tabela 2)
- Prepare 3 L de solução fresca. Use 1 L para preparar fatias de cérebro de um animal. Conservar a solução restante a 4 °C e utilizá-la no prazo de 3 dias.
NOTA: Altas concentrações de Mg2+ e baixas concentrações de Ca2+ são usadas para diminuir a transmissão sináptica, e parte do NaCl é substituído por sacarose para preservar o tecido.
- Soluções intracelulares
- Prepare com antecedência 100 mL de solução para gravações duplas de células inteiras (Tabela 3).
- Incluir metilsulfato para obter uma boa recuperação da morfologia celular. Adicione biocitina (0,1 - 0,4%) para examinar a morfologia do neurônio posteriormente. Inclua um corante fluorescente (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforrodamina 101 41) para acompanhar a extensão dos dendritos durante a gravação (opcional).
- Prepare com antecedência 100 mL de solução de eletrodo para gravações conectadas à célula (Tabela 4). Nesse caso, a solução interna é uma solução de alto K+ projetada para isolar a corrente catiônica ativada por hiperpolarização macroscópica (IH) e contém bloqueadores para os outros canais iônicos dependentes de voltagem.
- Armazene as soluções intracelulares em alíquotas de 2 mL a -20 °C. Use uma nova alíquota para cada nova sessão de gravação. Verifique cuidadosamente a osmolaridade de cada alíquota descongelada com um osmômetro. Pegue uma nova alíquota se a osmolaridade não corresponder ao valor inicial.
- Transfira a solução da alíquota para uma seringa de 3 ml, sobre a qual é colocado um filtro de seringa estéril de 0,22 μm. Mantenha a seringa no gelo durante a sessão de gravação para limitar a degradação de seus compostos (ATP, GTP ou fosfocreatina).
2. Fabricação e enchimento da pipeta de adesivo
- Puxando
- Use um extrator de eletrodo horizontal e um tubo de vidro borossilicato de paredes espessas. Para gravações de células inteiras e conectadas à célula, use um diâmetro externo de 2 mm/diâmetro interno de 1 mm. Certifique-se de que o tubo de vidro esteja absolutamente limpo.
- Se não for esse o caso, mergulhe os capilares de vidro em um solvente orgânico (por exemplo, etanol) primeiro e depois em água bidestilada Aqueça brevemente as terminações capilares com um bico de Bunsen. Como alternativa, solicite que os tubos de vidro sejam lavados e aquecidos diretamente do fabricante (consulte a lista de materiais).
- Para registros somatodendríticos duplos, certifique-se de que a resistência da pipeta somática esteja entre 6 e 10 MΩ e entre 8 e 19 MΩ para pipetas dendríticas quando preenchidas com solução intracelular (Tabela 3). Padronize a resistência da pipeta para gravações ligadas à célula para uma resistência de 10 MΩ para obter resultados comparáveis ao longo do domínio somatodendrítico do neurônio.
- Prepare pipetas novas antes de cada sessão de gravação (todos os dias) ou imediatamente antes do remendo e use-as 5 a 8 h após sua fabricação. Armazene as pipetas em um recipiente de vidro coberto para protegê-las contra poeira e obstrução da ponta.
- polimento
- Inspecione e faça o polimento térmico de cada ponta de pipeta com uma microforja para obter melhores vedações com a membrana. Antes de usar a microforja, derreta um pequeno pedaço de vidro no filamento de aquecimento de platina. Substitua este revestimento de vidro no filamento de platina diariamente para constância (Peter Jonas, comunicação pessoal).
nota: As pipetas usadas para gravações conectadas a células podem ser revestidas antes da etapa de polimento térmico para reduzir o ruído de fundo. Um agente isolante, como cera dental derretida ou um elastômero de silicone, pode ser usado para revestir as pipetas.
3. Preparação de fatias de cérebro
- Use ratos Wistar saudáveis com idade entre 16 e 19 dias. Não use animais insalubres ou animais que sofram de hipotermia ou desidratação. Antes de iniciar o preparo das fatias, mantenha o animal em local seguro e silencioso. Evite ter qualquer outro animal na sala enquanto prepara um animal. Manipule os animais suavemente.
- Despeje sacarose-ACSF em dois copos de polipropileno (PP) de 400 mL e coloque-os no freezer a -80 ° C por 45 min. Misture a solução para obter uma solução homogênea de líquido gelado/congelado e coloque os copos no gelo. Alimentar a solução de sacarose-ACSF com gás carbogénio utilizando uma vela de microfiltro (Ø 13 mm) em cada copo de PP.
- Prepare o fatiador e a câmara de reserva
- Use um cortador de tecido de alta qualidade com vibrações verticais extremamente baixas para minimizar ao máximo os danos às camadas superficiais das fatias. Fixe uma lâmina de barbear nova e inteira no fatiador.
- Use uma nova lâmina de barbear para cada sessão de corte. Evite dobrar a lâmina de barbear. Não remova a película gordurosa na superfície da lâmina de barbear (Josef Bischofberger, comunicação pessoal).
- Se disponível, verifique a vibração vertical com uma vibrosonda fornecida pelo fabricante. Como alternativa, use uma vibrosonda personalizada. Reduza as vibrações verticais da lâmina de modo a ficar o mais próximo possível de 0 μm.
- Prepare uma câmara de reserva de 150 mL para fatias. Despeje o ACSF padrão na câmara de reserva e coloque-o em banho-maria. Fornecer a solução da câmara de reserva com carbogénio utilizando uma vela de microfiltro (Ø 6 mm). Certifique-se de que as bolhas de carbogênio sejam as menores possíveis.
nota: Construa uma nova câmara de reserva a cada 2 a 3 meses para manter a qualidade da fatia constante.
- Corte fatias
- Em uma sala silenciosa em que o experimentador não seja perturbado ou estressado, decapite o animal com uma tesoura cirúrgica (comprimento de 150 mm) ao nível da medula cervical.
- Corte a pele do topo da cabeça do animal na direção nasal para caudal com um bisturi e remova-a lateralmente. Corte a parte superior do crânio da parte caudal para a parte nasal da cabeça com uma tesoura fina e remova as duas partes do crânio lateralmente. Remover o cérebro com uma espátula fina e colocá-lo cuidadosamente num copo de PP contendo sacarose-ACSF gelada (0 - 4 °C) equilibrada com carbogen.
nota: Essa sequência de etapas precisa ser feita o mais rápido possível, mas também meticulosamente (<<1 min, aproximadamente 40 s).
- Mantenha o cérebro na solução do béquer PP por ~ 2 a 5 min. Ajuste a pressão do carbogênio para evitar movimentos cerebrais. Se as bolhas de carbogênio forem muito grandes, substitua a vela do microfiltro por uma nova.
- Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 9 cm cujo fundo interno é coberto com uma camada de Sylgard de ~ 0,5 cm de espessura. Prepare esta placa de Petri com antecedência.
- Cerque o cérebro com sacarose gelada-ACSF. Certifique-se de que alguma fase líquida da solução de ACSF-sacarose submerja o cérebro. Para cortes coronais, corte a parte frontal do cérebro no plano coronal com um bisturi ou uma lâmina de barbear. Remova o cerebelo com um corte coronal.
- Aplique cola de cianoacrilato na bandeja de amostras (área ~ 1 cm2). Cole o bloco cerebral de forma que a parte frontal fique voltada para o estágio de corte. Goteje cuidadosamente a sacarose-ACSF no topo do cérebro colado usando a grande abertura de uma pipeta Pasteur de vidro e, em seguida, mergulhe lentamente a câmara de corte do fatiador. Manobre a bandeja de amostra para que a superfície de corte (ou seja, o primeiro tecido a atingir a lâmina) seja a superfície ventral do cérebro.
- Aplique o carbogênio com uma vela de microfiltro de vidro dobrado (Ø 6 mm) na câmara de corte (opcional).
- Ajuste a lâmina de barbear em um ângulo de ~15° em relação ao plano horizontal. Corte fatias coronais do cérebro de ~ 500 μm na direção caudal para nasal antes de atingir a substância negra. Diminua a espessura para cortar fatias de 300 a 350 μm de espessura contendo a região de interesse.
- Separe as fatias do bloco de tecido com uma agulha de perfusão muito fina presa a uma seringa paralela à borda da lâmina de barbear. Dobre a agulha de modo a ter um ângulo de 90° entre a agulha e a seringa. Certifique-se de que nenhuma pressão seja aplicada à lâmina de barbear ao remover a fatia do bloco de tecido.
- Armazenar fatias
- Transfira as fatias usando a maior abertura de uma pipeta Pasteur de vidro (conectada a um bulbo) para a câmara de reserva. Uma vez que todas as fatias são transferidas para a câmara de reserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicação pessoal), leve a temperatura do banho-maria a 34 ° C por 0,5 - 1 h.
- Após este período, desligue o banho-maria e mantenha as fatias em temperatura ambiente. Regular a pressão do carbogénio para evitar movimentos das fatias na câmara de reserva. Guarde as fatias por mais 10 a 20 minutos antes de iniciar as gravações.
- Limpe o equipamento e as velas do microfiltro cuidadosamente, mas completamente, com água bidestilada no final do procedimento de fatiamento.
4. Gravações somáticas e somatodendricas duplas em neurônios nigrais e arquivamento de biocitina
- Siga as descrições para a montagem de uma configuração de patch-clamp para fatias fornecidas no The Axon Guide.
- Prepare a câmara de gravação
- Coloque 1 - 2 mL de água bidestilada na câmara de registro. Verifique se não está vazando. Coloque a câmara de gravação na mesa x-y móvel.
- Alimente o ACSF padrão através de um sistema de tubulação de perfusão impermeável ao oxigênio (politetrafluoretileno) para a câmara de registro. Estabilize o fluxo de perfusão na câmara a uma taxa de 4 - 5 mL min-1. Manter o comprimento do tubo que une o copo que contém o ACSF e a câmara de registo o mais curto possível (1 m).
- Selecione uma fatia de cérebro da câmara de reserva e transfira-a para a câmara de gravação usando a maior abertura de uma pipeta Pasteur de vidro. Cubra a fatia com um anel de platina para ancorá-la na parte inferior da câmara de gravação. Use um anel de platina plano (Ø 1,5 cm) e cole fios de nylon paralelos (espaçamento >2 mm).
- Ajuste e otimize a ótica
- Visualize as fatias usando microscopia de vídeo infravermelho (IR). Ajuste a iluminação Köhler 51 e otimize a óptica de contraste de interferência diferencial (DIC) ou a iluminação oblíqua (Dodt Gradient contrast - DGC).
- Verifique a qualidade da fatia. Mantenha apenas fatias com superfícies lisas e uniformes que não sejam muito contrastadas e tenham apenas crateras pequenas e dispersas.
- Encha 2 pipetas de adesivo frescas e não utilizadas com solução intracelular (Tabela 3). Use um tubo de 0,5 mL contendo a solução da pipeta para encher a ponta da pipeta por ação de capilaridade. Para acelerar o enchimento da ponta de pipetas sem filamento, aplique pressão negativa na extremidade da pipeta usando um tubo conectado a uma seringa.
- Posicione as pipetas acima da superfície da fatia
- Verifique a presença de revestimento de cloreto nos fios de prata.
- Insira as pipetas sequencialmente nos porta-pipetas e aplique pressão positiva (~70 mbar) usando um circuito de tubulação conectando o porta-pipetas, uma torneira de três vias e um manômetro. Baixe a pipeta no banho da câmara de gravação.
- Verifique se o valor da pressão no manômetro é constante por ~1 - 2 min. Se a pressão estiver diminuindo, verifique a tubulação ou os anéis de vedação dentro do porta-pipeta.
- Coloque a ponta da pipeta no meio do monitor de vídeo e certifique-se de que não está obstruída. Certifique-se de que a ponta da pipeta não se mova ao aplicar ou liberar pressão na pipeta.
- Verifique se há desvio e vibrações da ponteira da pipeta desenhando uma pequena cruz no centro do monitor exatamente na posição da ponteira da pipeta e observe por 5 minutos os possíveis movimentos da ponteira.
- Aplique um passo de tensão (5 mV) para monitorar a resistência da pipeta em um osciloscópio. Defina o potencial de retenção do patch-clamp amplifier para 0 mV. Cancele o potencial de deslocamento da pipeta de modo que a corrente da pipeta CC seja zero no medidor do amplificador.
- Mova as pipetas para baixo até a fatia e mantenha-as acima da superfície.
- Selecione e remende um neurônio com dendritos longos
- Dentro da substância negra, selecione um neurônio saudável com dendritos longos que podem ser seguidos por uma longa distância aproximadamente no mesmo plano (Figura 1A e 1B) usando o IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Escolha um corpo celular liso e homogêneo. Evite as duas células fortemente contrastadas na superfície da fatia (Figura 1C e 1D), porque é difícil entrar e preservar condições de gravação estáveis ao longo do tempo (resistência em série estável). Selecione neurônios que tenham seu soma de 10 a 30 μm abaixo da superfície da fatia.
- Mova o eletrodo somático para perto do soma (40 - 50 μm de distância) e o eletrodo dendrítico para perto do dendrito na mesma distância. Use uma ampliação de 2X (trocador de quatro vezes) para selecionar e remendar uma parte de um dendrito. Obtenha no monitor uma ampliação absoluta de 2.100X sem ampliação (1X) e de 5.500X com uma ampliação de 2X.
- Libere levemente a pressão da pipeta somática em 10 mbar. Se necessário, regule a pressão da pipeta dendrítica e somática para evitar o deslocamento da estrutura celular (soma e dendrito) dentro da fatia.
- Posicione a pipeta dendrítica perto da membrana para ver uma pequena ondulação. Libere a pressão na ponta da pipeta e remende o dendrito enquanto controla a resistência da pipeta. Em condições ideais, apenas uma sucção muito leve é suficiente para obter uma boa vedação.
- Reduza a amplitude dos transientes de capacitância da pipeta o máximo possível em cima da etapa de corrente usando um pulso de tensão com alto ganho e pouca filtragem 51 e o osciloscópio. Entre no modo de célula inteira com a pipeta dendrítica.