Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Registros eletrofisiológicos para investigar a atividade espontânea e dependente da estimulação de eletrodos
- Lavar a cultura multielectrodo (MEA) com solução extracelular, à temperatura ambiente (RT).
- Seque os contatos com um lenço de papel e monte o MEA na configuração MEA.
nota: Para manter a cultura úmida durante a montagem, adicione uma pequena gota de solução extracelular à cultura.
- Adicione 300 μl de solução extracelular e aguarde 10 minutos antes de gravar, para permitir que o sistema se estabilize.
- Registre a atividade espontânea por 2 min de todos os eletrodos pressionando o botão gravar/adquirir do software e identifique os eletrodos de gravação.
- Estimulação com eletrodo MEA: Selecione a amplitude/duração/forma do estímulo no software apropriado e aplique-o a vários eletrodos consecutivamente. Selecione os eletrodos com base naqueles que mostram atividade espontânea (como na etapa 1.4). Registre de todos os eletrodos restantes.
- Para excluir o artefato de estimulação, estimule do mesmo eletrodo 10 vezes. Se a cultura responder pelo menos 8 em cada 10 vezes, pode ser assumida como uma resposta positiva após a estimulação induzida pelo eletrodo.
- Para identificar o ruído de fundo, aplique Tetrodotoxina (TTX) à cultura na concentração de 1 μM, para bloquear os canais de sódio dependentes de voltagem e registre por 2 min. Use isso para realizar a detecção de pico (2.1 e 2.2).
2. Análise dos dados
- Usando o software apropriado, detecte a atividade espontânea para cada eletrodo, empregando um detector baseado em desvios padrão e um discriminador subsequente. A atividade aparece como transientes de tensão rápida (<5 ms).
- Escolha um limite que resulte em nenhuma atividade ao analisar as amostras tratadas com TTX. Adapte o valor limite para cada experimento para discriminar entre detecções de falsos positivos e falsos negativos.
- Usando o software apropriado, observe a atividade neuronal detectada de cada eletrodo como um gráfico raster de acordo com os procedimentos padrão (ver Figura 1A-C).
- Determine e exiba a atividade total da rede somando todos os eventos detectados em uma janela deslizante de 10 ms, deslocada em etapas de 1 ms.
- Detecte a atividade induzida por estimulação exibindo os dados brutos usando o software de análise apropriado. Identifique os picos únicos offline manualmente. Picos únicos aparecem como transientes de tensão rápida, ocorrendo após o artefato de estimulação (ponta de seta na Figura 1E). Um exemplo é mostrado na Figura 1E.
- Dependendo do experimento, analise o número de eletrodos de resposta, o limite necessário para obter uma resposta, o número de potencial de ação por eletrodos e outros parâmetros de interesse.
