Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e deve ter uma licença válida para realizar experimentos com animais.
1. Anestesia e pré-medicação
- Anestesiar um rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital sódico (uma dose inicial de 60 mg·kg-1 para ratos Wistar machos de 6 meses de idade, pesando 400\u2012550g).
nota: Este protocolo não se limita à cepa, sexo ou idade indicados dos ratos. Além disso, anestesia alternativa, como mistura de cetamina-xilazina, alfa-cloralose ou fentanil + midazolam + medetomidina, pode ser usada se for mais adequada para diferentes objetivos de pesquisa ou quando exigida pelo comitê de ética.
- Após aproximadamente 5 min, verifique a profundidade da anestesia beliscando o dedo do membro posterior do rato com uma pinça romba. Prossiga com as próximas etapas do protocolo somente quando nenhuma ação reflexa for observada.
- Injete 0,05 mL de atropina por via subcutânea para reduzir a produção de muco após a intubação.
- Injete por via subcutânea 5 mL de tampão fosfato contendo solução de glicose a 4%, NaHCO3 (1%) e gelatina (14%). Esse tampão será absorvido pelos vasos cutâneos ao longo de um experimento e ajudará a manter o equilíbrio de fluidos.
- Durante toda a cirurgia, verifique periodicamente o animal quanto a ações reflexas e complemente a anestesia, se necessário (10 mg · kg-1 · h-1 de pentobarbital sódico).
2. Cirurgia
- Prepare o animal para o tratamento cirúrgico raspando o pelo sobre a parte dorsal do membro posterior esquerdo, do tornozelo ao quadril, a parte traseira, da cauda aos segmentos torácicos altos (Th), o lado esquerdo do tórax e o lado ventral da área do pescoço acima do esterno
- Colocação da linha intravenosa
- Coloque o rato de costas em uma almofada de aquecimento de circuito fechado (e prenda-o com fixações de membros).
- Usando uma lâmina de 21, faça um corte longitudinal na pele do esterno ao queixo.
- Segure a pele com uma pinça e separe-a do tecido subjacente.
- Usando técnicas de dissecção romba, exponha a veia jugular direita. Disseque cuidadosamente a veia dos tecidos circundantes.
- Localize a parte da veia sem pontos de ramificação e deslize duas ligaduras 4-0 por baixo dela.
- Faça um nó solto na extremidade proximal do segmento não ramificado da veia previamente identificado e um nó solto na extremidade distal deste segmento da veia. Aperte a veia proximal ao coração e, em seguida, ligue a parte distal da veia.
- Usando uma tesoura de íris, faça uma incisão entre a pinça e a ligadura distante. Segure uma aba da veia e introduza um cateter pré-cheio até o ponto em que ele esteja bloqueado pela pinça.
- Enquanto segura a veia e o cateter juntos com uma pinça, remova a pinça e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia. Prenda ambas as extremidades do cateter à veia e adicione um ponto de fixação adicional à pele.
3. Introdução do tubo traqueal
- Usando uma pinça romba, separe as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esterno-hióideos. Separe os músculos esterno-hióideos na linha média para expor a traqueia.
- Deslize três ligaduras 4-0 sob a traqueia e, em seguida, faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.
- Localize a cartilagem cricoide da laringe e faça uma incisão abaixo da terceira cartilagem traqueal.
- Insira um tubo traqueal na traqueia e prenda o tubo no lugar com ligaduras pré-preparadas e, em seguida, adicione uma ligadura adicional à pele.
- Coloque um pequeno pedaço de algodão acima dos músculos separados e suture a pele sobre a área operada.
4. Dissecção dos nervos dos membros posteriores
- Usando uma lâmina 21, faça um corte longitudinal na parte posterior do membro posterior esquerdo, do tendão de Aquiles ao quadril.
- Agarre a pele com uma pinça e, usando técnicas de dissecção romba, separe a pele dos músculos subjacentes em ambos os lados da incisão.
- Localize a fossa poplítea na parte de trás da articulação do joelho, que é coberta pelo músculo bíceps femoral e, usando uma tesoura, faça um corte entre a parte anterior e posterior desse músculo.
- Movendo-se para cima, corte duas cabeças do bíceps femoral até o quadril para expor o nervo ciático. Cauterize conforme necessário para evitar sangramento.
- Identifique os ramos sural, tibial e fibular comum do nervo ciático.
- Usando uma tesoura, separe a cabeça lateral da medial do músculo gastrocnêmio para expor o nervo tibial e seus ramos.
- Usando 55 pinças, agarre a extremidade distal do nervo sural, corte-o distalmente e disseque-o o máximo possível.
- Repita o procedimento com o nervo fibular comum.
- Usando uma haste de vidro romba, separe o nervo tibial dos tecidos circundantes, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos, e corte-o distalmente.
- Identifique os nervos gastrocnêmio medial (MG) e gastrocnêmio lateral e sóleo (LGS).
- Usando 55 pinças, disseque cuidadosamente os nervos MG e LGS, desconectando-os dos tecidos circundantes, mas mantendo sua conexão com os respectivos músculos.
- Coloque um pedaço de algodão embebido em solução salina sob os nervos expostos.
- Feche a pele sobre a área operada.
5. Laminectomia
- Usando uma lâmina 21, faça uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.
- Separe a pele dos músculos subjacentes.
- Corte o músculo longuíssimo em ambos os lados dos processos espinhosos torácicos e lombares.
- Usando um bisturi de ponta romba, retraia os músculos da coluna vertebral para expor os processos transversos de cada vértebra.
- Usando uma tesoura de ponta romba, corte os tendões dos músculos conectados aos processos transversos ao longo da coluna vertebral exposta. Aplique agentes hemostáticos se necessário.
- Identifique a vértebra Th13 como o segmento torácico mais baixo com inserção de costela e, usando rongeurs finos, remova processos espinhosos e lâminas das vértebras Th13 a L2 para expor os segmentos lombares da medula espinhal. Lembre-se de não danificar o processo espinhoso L3, que será usado como ponto de fixação para estabilização da coluna.
- Remova o processo espinhoso Th12 e alise a superfície dorsal da vértebra o máximo possível.
- Usando técnicas de dissecção romba, separe os músculos da vértebra Th11 para criar pontos de inserção do suporte.
- Coloque algodão fino e embebido em solução salina sobre os segmentos expostos da medula espinhal.
- Mova o rato para a estrutura de metal feita sob medida com duas barras paralelas e dois braços ajustáveis com grampos para apoiar e estabilizar a coluna.
6. Preparação para a gravação e estimulação
- Fixação da coluna vertebral e arranjo nervoso
- Coloque o rato na estrutura feita sob medida em uma almofada de aquecimento conectada ao sistema de aquecimento em circuito fechado para manter a temperatura corporal do animal em 37 ± 1 ° C.
- Insira eletrodos de eletrocardiograma (ECG) sob a pele e conecte a um amplificador para monitoramento da frequência cardíaca.
- Usando as abas de pele, forme uma poça profunda sobre a medula espinhal exposta.
- Usando grampos de metal, fixe a coluna vertebral colocando grampos abaixo dos processos transversos Th12 e no processo espinhoso L3.
- Certifique-se de que a coluna vertebral esteja presa e disposta horizontalmente e, em seguida, aplique pressão dorso-ventral em ambos os lados da coluna para retrair os músculos.
- Encha a piscina com óleo mineral morno (37 °C) e mantenha-a a esta temperatura.
- Passe uma ligadura 4-0 pelo tendão de Aquiles, levante e estique o membro posterior esquerdo operado para que o tornozelo fique nivelado com o quadril.
- Usando os retalhos cutâneos, faça uma poça profunda sobre os nervos tibial, MG e LGS expostos.
- Encha a piscina com óleo mineral morno (37 °C).
- Coloque os nervos MG e LGS em eletrodos estimuladores bipolares de fio de prata e conecte-os a um estimulador de pulso quadrado. Use canais de estimulação separados para cada nervo.
7. Colocação do eletrodo de superfície
- Coloque um eletrodo de bola de prata no lado caudal esquerdo da medula espinhal exposta, com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas, e conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. O eletrodo de bola de superfície será usado para registrar voleios aferentes dos nervos.
- Usando um estimulador de corrente constante, estimule os nervos MG e LGS com pulsos quadrados de 0,1 ms de duração, repetidos na frequência de 3 Hz, e observe voleios aferentes.
- Determine o limiar (T) para a ativação do nervo, estimule cada nervo com intensidade aproximada de 3·T e registre a amplitude da saraivada aferente para cada nervo.
- Mova o eletrodo de superfície rostral e repita o procedimento para identificar os segmentos da coluna vertebral nos quais as amplitudes das voleios, são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização máxima do voleio, mova o eletrodo de superfície para uma distância segura da medula espinhal.
- Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios
- Paralisar o rato por via intravenosa com um bloqueador neuromuscular e conectar o tubo traqueal a um ventilador externo alinhado com um capnômetro compatível com roedores (brometo de pancurônio, na dose inicial de 0,4 mg · kg-1, suplementado a cada 30 min em doses de 0,2 mg · kg-1)
- Monitore a concentração de CO2 expirado e mantenha-a em cerca de 3\u20124% ajustando os parâmetros de ventilação (frequência, pressão do ar e volumes de fluxo).
- Faça uma incisão longitudinal na pele entre a 5ª e a 6ª costela na lateral da gravação.
- Usando uma tesoura de ponta romba, corte os músculos sobrepostos para visualizar o espaço intercostal entre as costelas.
- Usando uma tesoura pequena e afiada, faça uma pequena incisão nos músculos intercostais e na pleura e, em seguida, insira a ponta de uma pinça de ponta romba na abertura, tomando cuidado para não pressionar os pulmões.
- Permita que o fórceps se expanda ou insira um pequeno tubo para manter o pneumotórax aberto durante todo o experimento.
- Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico se a frequência cardíaca exceder 400 bpm. Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios, o que melhorará a estabilidade do registro.
8. Abrindo a dura-máter e a pia-máter
- Usando uma pinça #55, levante suavemente a dura-máter e corte-a caudalmente do segmento L5, rostralmente até o segmento L4.
- Usando um par de pinças 5SF ultrafinas, faça um pequeno remendo na pia cobrindo a coluna dorsal entre os vasos sanguíneos, exatamente no nível da saraivada aferente máxima do nervo MG ou LGS.
- Use pequenos pedaços de espuma de gel seca e embebida em solução salina para bloquear o sangramento, se necessário.
9. Colocação de eletrodo de estimulação por corrente contínua transespinhal (tsDCS)
- Faça uma pequena incisão na pele no lado ventral do abdômen de um rato no nível rostrocaudal correspondente à localização dos segmentos lombares (L)4-L5 da coluna vertebral.
- Pegue o retalho de pele exposto com um clipe de metal, que servirá como eletrodo de referência.
- Coloque uma esponja embebida em solução salina no lado dorsal da vértebra torácica (Th) 12. Certifique-se de que o tamanho da esponja seja igual ao de um eletrodo tsDCS ativo (placa de aço inoxidável em forma de círculo de 5 mm de diâmetro).
- Usando um manipulador fino, pressione a esponja com um eletrodo tsDCS ativo até o osso e certifique-se de que toda a superfície do eletrodo seja pressionada igualmente.
- Conecte os eletrodos tsDCS de referência e ativos a uma unidade estimuladora de corrente constante capaz de fornecer um fluxo contínuo de corrente contínua.
10. Preparação de micropipetas
- Usando um extrator de microeletrodo, prepare um microeletrodo.
nota: Eletrodos de filamento e não filamento podem ser usados. No entanto, lembre-se de que a haste do eletrodo deve ser longa o suficiente para alcançar o corno ventral e ser fina o suficiente para não comprimir a medula espinhal durante a descida.
- Ajuste a configuração do extrator para que a haste que entra na medula espinhal tenha aproximadamente 3 mm de comprimento, enquanto a ponta do eletrodo não tenha mais de 1\u20122 μm de diâmetro e a resistência do microeletrodo esteja entre 10 e 20 MΩ.
- Encha os microeletrodos com eletrólito de citrato de potássio 2M.
- Monte o microeletrodo preparado no micromanipulador, permitindo movimento de passo de 1\u20122 μm e calibração estereotáxica.
- Conecte o microeletrodo ao amplificador intracelular com o eletrodo de referência colocado nos músculos das costas.
- Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do eletrocardiograma (ECG) e complemente o agente anestésico para que a frequência cardíaca do rato não exceda 400 bpm.
11. Rastreamento e penetração de motoneurônios
- Colocar o eléctrodo de registo de voleio aferente de volta na superfície dorsal da medula espinal, caudalmente ao local do registo, ao nível do segmento L6.
- Estimule os nervos gastrocnêmio medial (MG) e lateral do gastrocnêmio e sóleo (LGS) com pulsos elétricos de 0,1 ms a uma frequência de 3 Hz e intensidade 3T para ativar todos os axônios dos alfa-motoneurônios dentro de um nervo selecionado.
- Insira a micropipeta em um adesivo selecionado na pia com um ângulo mediolateral de 15\u201220° (com uma ponta direcionada lateralmente).
- Depois de descer abaixo da superfície, calibre o microeletrodo e compense sua capacitância e deslocamento de tensão, e continue a penetração da medula espinhal quando todos os parâmetros estiverem estáveis. Um potencial de campo antidrômico do pool de motoneurônios será visível no traço de voltagem do microeletrodo ao se aproximar de um núcleo motor dedicado durante a estimulação do respectivo nervo.
- Prossiga com a penetração com o microeletrodo em passos de 1\u20122 μm e use periodicamente a função de zumbido do amplificador intracelular para limpar a ponta do eletrodo de qualquer resíduo.
- Observe a penetração do motoneurônio, que será caracterizada por uma hiperpolarização repentina do traço de tensão registrado e o aparecimento de um potencial de pico antidrômico.
12. Registro da membrana do motoneurônio e propriedades de disparo
- Em um modo de ponte do amplificador intracelular, identifique o motoneurônio com base na aparência "tudo ou nada" do potencial de ação antidrômica, estimulando os respectivos ramos nervosos. Registre 20 rastreamentos subsequentes para média posterior.
- Implementar um critério de inclusão rigoroso para garantir dados de alta qualidade: potencial de membrana em repouso de pelo menos -50 mV em amplitude; amplitudes do potencial de ação superiores a 50 mV, com um overshoot positivo; potencial de membrana estável por pelo menos 5 minutos antes do registro.
- Em um modo de pinça de corrente descontínua (modo de taxa de comutação de corrente 4–8 kHz) do amplificador intracelular, evoque um potencial de ação ortodrômica em um motoneurônio usando pulsos de corrente despolarizante intracelular de 0,5 ms. Repita pelo menos 20 vezes para obter a média offline.
- Estimule um motoneurônio com 40 pulsos curtos (100 ms) de corrente hiperpolarizante (1 nA) para calcular a resistência de entrada da célula.
- Estimule um motoneurônio com pulsos de onda quadrada de 50 ms em amplitudes crescentes para determinar o valor reobase como a amplitude mínima de corrente despolarizante necessária para provocar um único pico.
- Injete pulsos de onda quadrada de 500 ms de corrente despolarizante, em amplitudes crescentes em passos de 0,1–2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurônios.
13. Estimulação transespinhal por corrente contínua (tsDCS)
- Enquanto mantém uma penetração estável do motoneurônio, inicie o procedimento de polarização por aplicação transespinhal de corrente contínua. Ajuste a intensidade da corrente e o tempo de aplicação ao desenho do experimento (por exemplo, 0,1 mA por 15 min).
- Imediatamente após ligar a CC, observe o potencial de membrana do motoneurônio. A polarização anódica (o eletrodo ativo como ânodo) deve resultar na despolarização do potencial de membrana, enquanto a polarização catódica (o eletrodo ativo como cátodo) deve evocar um efeito oposto. Observe se uma mudança no potencial de membrana em repouso em resposta à estimulação CC é constante, o que garante que a intensidade do campo elétrico não seja afetada.
- Durante a aplicação de corrente contínua, repita as etapas 5.3 a 5.6 em intervalos de 5 minutos.
- Desligue o DC e continue a repetir as etapas 5.3 a 5.6 em intervalos de 5 minutos até que as gravações se tornem instáveis ou os critérios de inclusão sejam comprometidos.
- Terminar a experiência e eutanasiar o animal com a administração intravenosa de uma dose letal de pentobarbital sódico (180 mg·kg-1).
awy Sp. z o.o