Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Animais
NOTA: Os ratos foram obtidos do Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Austrália) e realizada na Medical Foundation Building Animal Facility da Universidade de Sydney.
- Mantenha os camundongos em um ciclo padrão de 12 horas de luz / escuridão com enriquecimento ambiental.
- Use camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas (3-5 semanas de idade) para todos os experimentos.
2. Preparação de Soluções
- Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) composto de 29 mM de NaHCO3, 11 mM de glicose, 120 mM de NaCl, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH2PO4, 2,2 mM de MgCl2, 2,77 mM de CaCl2.
- Prepare 200 mL de sacarose-ACSF (sACSF) contendo 29 mM de NaHCO3, 11 mM de glicose, 241,5 mM de sacarose, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH2PO4, 2,2 mM de MgCl2, 2,77 mM de CaCl2. Antes de adicionar CaCl2 ao ACSF e sACSF, gaseie as soluções com carbogênio (95% O2 e 5% CO2) para estabelecer um pH de 7,4 e evitar a precipitação de cálcio (turvação).
- Prepare a solução intracelular à base de K+} composta por gluconato de potássio 70 mM, KCl 70 mM, NaCl 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 4 mM, 4 mM Mg2-ATP, 0,3 mM Na3-GTP, com um pH final de 7,3 (ajustado usando KOH).
NOTA: Recomenda-se que as soluções intracelulares sejam filtradas com filtros de 0,22 μm e armazenadas em alíquotas de 0,5 mL a -20 °C.
3. Preparação do tronco encefálico
- Antes da extração do tronco encefálico, equilibre o sACSF com carbogênio e resfrie a -80 ° C por 25 min para formar uma pasta de gelo.
- Anestesie o camundongo com isoflurano (3-5%) saturado em oxigênio (3 mL / min). Uma vez que os reflexos da pata traseira estejam ausentes, decapite o rato com uma tesoura afiada de aço inoxidável.
- Exponha o crânio fazendo uma incisão sagital na pele usando uma lâmina de barbear (# 22 arredondada).
- Usando a ponta pontiaguda de uma tesoura de padrão padrão, faça uma pequena incisão na lambda e corte ao longo da fissura longitudinal.
- Reflita cuidadosamente os ossos parietais e occipitais emparelhados usando um par de rongeurs Pearson de curva rasa.
NOTA: O cérebro é continuamente banhado in situ usando a pasta sACSF gelada previamente preparada durante este procedimento.
- Isole o tronco encefálico do prosencéfalo e seu invólucro ósseo usando uma lâmina de barbear (# 11 reta) para cortar o sulco parieto-occipital e na medula caudal.
- Monte a extremidade ventral isolada do tronco encefálico em um bloco de poliestireno trapezoidal previamente cortado. Use um pavio de papel de seda para remover o excesso de fluido ao redor do tecido dissecado e garantir uma boa adesão do tecido ao estágio de corte.
NOTA: O bloco de poliestireno é cortado em forma trapezoidal para garantir que a extremidade rostral do mesencéfalo se encaixe e se afunile na medula espinhal.
- Use cola de cianoacrilato para fixar o bloco de poliestireno com a extremidade rostral do tronco encefálico anexada até o estágio de corte.
- Usando uma velocidade de avanço de 0,16 mm/s e amplitude de vibração de 3,00 mm, prepare fatias transversais de 200 μm do MVN.
NOTA: A localização do MVN é determinada usando o atlas cerebral de camundongos Paxinos e Franklin. O MVN (listado como MVe no atlas) fica imediatamente ventrolateral ao 4º ventrículo e é maior logo antes da fixação do cerebelo (entre os colículos inferiores e o obex).
- Utilizar uma pipeta de plástico para transferir as fatias para um disco de papel de filtro em ACSF carbogenado a 25 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da gravação.
4. Instrumentos
- Use uma configuração eletrofisiológica padrão para realizar a técnica de patch clamp de célula inteira.
- Prepare as micropipetas usando um protocolo de duas etapas (etapa de calor 1: 70; etapa de calor 2: 45) em um extrator de micropipetas (consulte a Tabela de Materiais).
- Quando colocadas no banho, as micropipetas devem ter uma resistência final variando de 3 a 5 MΩ com uma solução interna.
NOTA: As configurações usadas podem variar dependendo da temperatura dentro da sala e podem mudar com bastante frequência.
5. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira
- Para obter registros de patch clamp de células inteiras de neurônios individuais no MVN, uma solução interna baseada em K + é usada dentro da pipeta de registro.
- Transfira uma única fatia de tecido da câmara de incubação para a câmara de registro e prenda-a usando fio de náilon em um peso em forma de U. Perfundir continuamente a câmara de registo com ACSF carbogenado a 25 °C a um débito de 3 ml/min.
- Depois de encher uma micropipeta com solução interna, localize o MVN usando uma lente objetiva de baixa potência (10x). Usando uma objetiva de alta potência (40x), neurônios individuais dentro do MVN podem ser localizados.
NOTA: A qualidade da célula é essencial para garantir gravações de qualidade e durabilidade da célula ao tentar obter a configuração de toda a célula. Uma célula adequada demonstrará uma forma esférica, uma membrana celular reflexiva e um núcleo invisível. Uma célula inadequada terá um grande núcleo visível (semelhante a um ovo) e uma aparência inchada / encolhida.
- Antes de romper o tecido com a pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva para empurrar os detritos para longe da ponta da pipeta.
- Mova a pipeta usando o micromanipulador em direção ao neurônio escolhido e uma pequena covinha deve se formar na membrana neuronal.
Libere a pressão positiva e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa.
- Uma vez que uma vedação de 1 GΩ seja alcançada, aplique uma pressão negativa suave, curta e aguda ao porta-pipeta através da porta de sucção para romper a membrana e criar uma configuração de célula inteira.
- Faça gravações de pinça de corrente de célula inteira usando técnicas padrão.
6. Aplicação de ruído sinusoidal e estocástico a neurônios individuais do núcleo vestibular medial
- Aplique o ruído estocástico e sinusoidal em uma faixa de amplitudes de 3 a 24 pA para determinar o limiar neuronal e a taxa de disparo.
- Determine o limiar sensorial agrupando intensidades de estímulo mais baixas e mais altas e realize uma ANOVA para observar quaisquer diferenças (como mostrado em Figura 1).
- Calcule a taxa média de disparo durante o período de 10 s em que a etapa de corrente despolarizante foi/será injetada para cada nível de corrente individual (ou seja, 7 episódios totais; Figura 2).
- Use os valores médios da taxa de disparo para gerar uma taxa de disparo em relação ao gráfico atual e execute uma análise de regressão linear para determinar o gradiente da linha de melhor ajuste. O gradiente da linha de melhor ajuste indica ganho neuronal.
