Detecção de níveis de peróxido de hidrogênio em neurônios cultivados por meio de imagens de fluorescência de células vivas

Resumo

Fonte: Terzi, A. et al., ROS Imagens de células vivas durante o desenvolvimento neuronal.J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar níveis de peróxido de hidrogênio em tempo real em células ganglionares da retina usando o biossensor roGFP2-Orp1 e técnicas de imagem de células vivas. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação celular, imagens de fluorescência e quantificação dos níveis de peróxido de hidrogênio.

Protocolo

1. Imagens in vitro de espécies reativas de oxigênio (ROS) de neurônios cultivados de células ganglionares da retina (RGC)

1. No dia da imagem (normalmente 6-24 h após o plaqueamento celular), verifique as células ganglionares da retina ao microscópio para validar o crescimento dos axônios RGC.
2. Para imagens de células vivas, transfira lamínulas da placa de cultura para uma câmara de imagem de células vivas.
3. Configure o microscópio para imagens de imagem. Use um microscópio invertido equipado com uma objetiva de contraste de interferência diferencial (DIC), filtro vermelho passa-longo OG590 e uma câmera EM-CCD.
4. Antes da aquisição de imagens, substitua o meio de cultura de células de peixe-zebra por soro e antibióticos (ZFCM)(+)) por meio de cultura de células de peixe-zebra sem soro e antibióticos (ZFCM(-)).
5. Uma vez que as células estejam posicionadas com objetiva de 10x, adquira imagens com ampliação de 60x usando uma objetiva de imersão em óleo de alta NA. Use uma ampliação adicional de 1,5x.
6. Primeiro, adquira imagens DIC. Em seguida, crie a imagem roGFP2-Orp1 usando um conjunto de filtros apropriado. Excite roGFP2-Orp1 com filtros de excitação de 405/20 e 480/30 nm sequencialmente e adquira imagens com filtro de emissão de 535/30 nm após a luz de emissão ter passado pelo espelho dicróico 505DCXR.
7. Depois de tirar o primeiro conjunto de imagens, troque a mídia por mídia contendo diferentes soluções de tratamento. O meio deve ser trocado a cada 30 minutos de imagem para evitar alterações de pH e osmolaridade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de 35 mm	Sarstedt	83-3900
Vidro de cobertura	Corning	2850-22
Placas de Petri descartáveis (100 x 15 mm)	VWR	Rolamento 25384-094
Soro fetal bovino	ThermoFisher Scientific	26140087
Microscópio invertido	Nikon	TE2000
Laminina	ThermoFisher Scientific	Rolamento 23017-015
Meio L-15 de Leibovitz com vermelho de fenol	Gibco / Fisher Científico	11-415-064
Meio L-15 de Leibovitz sem vermelho de fenol	Gibco / Fisher Científico	21-083-027
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Vermelho de fenol	Sigma Aldich	Pág. 0290
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma Aldich	Pág. 7280
Filtro Steritop de 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fisher Científico	C79-500
glicose	Sigma Aldrich	G7528
HEPES	Sigma Aldrich	H4034