Todos os procedimentos que envolvem amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada.
1. Preparação Preliminar (Opcional: Prepare com 1 dia de antecedência)
- Prepare três tipos de solução de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (Soluções Normal, Sacarose e Recuperação, 1 L cada; ver Tabela 1). Ajustar a osmolalidade das soluções a 300 ± 10 mOsm e arrefecer a sacarose ACSF até um ponto próximo de congelação (0-4 °C).
nota: O uso de uma solução cortante com baixo teor de sódio (ACSF-Sacarose) ajuda a preservar a viabilidade dos neurônios nas camadas superficiais dos cortes agudos.
- Prepare 0,75 mL de solução adesiva contendo um fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594) e um indicador de cálcio sintético verde (por exemplo, Oregon Green BAPTA-1; consulte a Tabela 1). Incluir biocitina (ver quadro 1) na solução do adesivo se for necessária a identificação morfológica post hoc das células registadas.
- Ajustar a osmolalidade da solução para 280 ± 5 mOsm e o pH para 7,35 ± 0,5. Mantenha a solução na geladeira ou no gelo o tempo todo.
nota: A escolha do indicador de cálcio deve basear-se na sua gama dinâmica e na natureza dos eventos de Ca2+ investigados.
- Usando um extrator de micropipetas, prepare pipetas de adesivos de capilares de vidro de borossilicato (consulte a Tabela de Materiais) com uma ponta de ≈ 2 μm (resistência da pipeta de 3-5 MΩ) e pipetas de estimulação de capilares de vidro de borossilicato (consulte a Tabela de Materiais) com uma ponta de 2-5 μm.
nota: As configurações do extrator para fazer pipetas de um determinado diâmetro e formato serão determinadas pelo tipo de filamento do extrator e pelos resultados do teste de rampa para um determinado tipo de vidro.
2. Gravações de patch-clamp de célula inteira
- Coloque uma fatia de hipocampo no lugar em um banho posicionado sob a objetiva (ampliação: 40x, abertura numérica: 0,8) de um microscópio de dois fótons de varredura a laser. Perfundir continuamente o banho com ACSF-Normal oxigenado aquecido a 30-32 °C a uma taxa de 2,5-3 mL/min.
- Use contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) ou microscopia Dodt-SGC para localizar uma célula de interesse usando seu tamanho, forma e posição.
nota: Dependendo da população de neurônios alvo, um modelo de camundongo transgênico pode ser usado para localizar células de interesse facilmente. Nesse caso, essa etapa pode ser substituída pelo uso de uma fonte de luz fluorescente.
- Encha uma pipeta de estimulação com uma solução ACSF-Normal contendo o fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594).
- Coloque a pipeta de estimulação (conectada a uma unidade de estimulação elétrica) no topo da fatia de modo que a ponta fique na mesma região da célula de interesse.
- Depois de encher a pipeta de adesivo com solução de adesivo e conectá-la a um estágio de cabeça, coloque-a sobre a fatia de modo que sua ponta fique diretamente acima da célula de interesse.
- Encaixe uma seringa em uma torneira de três vias e conecte-a à pipeta através do tubo de plástico. Injete pressão positiva constante na pipeta de remendo (≈ 0,1 mL) usando a seringa. Mantenha a torneira em uma posição "fechada".
- Ative o módulo de software de controle do amplificador e mude para o voltage clamp modo clicando no botão "VC". Abra o software de aquisição de dados de eletrofisiologia (por exemplo, clampex) para a aquisição de sinais eletrofisiológicos e clique no ícone "Teste de membrana" para que ele envie continuamente um pulso de tensão quadrada (5 mV, 10 ms), que é necessário para monitorar as mudanças na resistência da pipeta.
- Abaixe a pipeta de adesivo até que esteja bem em cima da célula alvo. Ao entrar em contato com a membrana celular, remova a pressão girando a torneira para a posição "aberta"
nota: O contato com a membrana celular é detectado quando um pequeno aumento na resistência da pipeta (≈ 0,2 MΩ) é observado e um pequeno recuo na célula é causado por pressão positiva.
- Aplique uma leve pressão negativa na pipeta de remendo usando uma seringa vazia instalada na torneira até que a resistência da pipeta fornecida pelo software atinja 1 GΩ. Na janela 'Teste de membrana' do software de aquisição de dados, clamp a célula em -60 mV.
- Continue aplicando pressão negativa até que a célula seja aberta e a configuração de toda a célula seja alcançada. A detecção desse estado celular é baseada na mudança repentina na resistência da pipeta (de 1 GΩ a 70-500 MΩ, dependendo do tipo de interneurônio) e no aparecimento de grandes transientes capacitivos na janela 'Teste de Membrana'.
3. Cálcio (Ca2+) de dois fótonsImagiologia
- Se estiver interessado nas respostas pós-sinápticas excitatórias, adicione o bloqueador do receptor GABAA gabazina (10 μM) e o bloqueador do receptor GABAB CGP55845 (2 μM) ao banho de ACSF.
- No módulo de software de controle do amplificador, defina a configuração do patch para corrente-clamp clicando no botão "CC" e registre o padrão de disparo da célula em resposta a injeções somáticas de corrente despolarizante (0.8-1.0 nA, 1 s). Aguarde pelo menos 30 min para que a célula seja preenchida com os indicadores presentes na solução do patch.
nota: O padrão de disparo da célula e as propriedades ativas podem ser usados para identificar seu subtipo, por exemplo, células de pico rápido. É importante que a concentração do indicador se estabilize por difusão antes de começar a registrar transientes de cálcio (CaTs) (consulte a Tabela 2 para solução de problemas).
- CaTs evocados por PA
- Usando o software de aquisição de imagens, comece a adquirir imagens. Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho. Para garantir uma resposta visível, primeiro escolha um dendrito proximal (≤ 50 μm), pois a eficiência da retropropagação AP pode diminuir significativamente com a distância nos interneurônios GABAérgicos.
- Usando a 'ferramenta retangular' no software de aquisição de imagem, amplie a região de destino e mude para o modo "xt" (varredura de linha). Posicione a varredura através do ramo dendrítico de interesse. Com os controladores de intensidade do laser no software de aquisição, defina o laser de dois fótons em um nível de potência mínimo em que a fluorescência verde da linha de base seja apenas ligeiramente visível para evitar fototoxicidade.
- Na janela 'Protocolo' do software de aquisição de dados de eletrofisiologia e no software de aquisição de imagem, crie um teste de gravação da duração desejada contendo uma injeção de corrente somática da amplitude desejada.
- Usando o software de aquisição de imagem, clique no botão "Iniciar gravação" e adquira a fluorescência continuamente por 1-2 s. Repita a aquisição de imagem 3-10 vezes. Aguarde pelo menos 30 s entre as varreduras únicas para evitar fotodanos. Se adquirir varreduras de linha em vários pontos ao longo de um dendrito, pegue-as em ordem aleatória para evitar efeitos de ordem.
- CaTs evocados sinapticamente
- Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelho.
- Coloque a pipeta de estimulação na superfície da fatia acima do dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação no lugar, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de toda a célula. Posicione a pipeta a 10-15 μm do dendrito.
- Para visualizar a localização de microdomínios sinápticos em dendritos espinhosos, no software de aquisição de imagem, mude para o modo 'xt' (varredura de linhas) e posicione a linha ao longo do ramo dendrítico de interesse.
- Na janela 'Protocolo' (do software de aquisição de dados de eletrofisiologia) e no software de aquisição de imagem, crie um teste de gravação que acione a unidade de estimulação após o início do teste.
- Usando o software de aquisição, clique no botão "Iniciar registro" para escanear ao longo do dendrito continuamente por 1-2 s. Repita a aquisição 3-5 vezes, aguardando 30 s entre as varreduras para evitar fotodanos.
nota: A duração da varredura pode ser ajustada dependendo da cinética do evento evocado, mas deve ser minimizada para evitar fotodanos (consulte a Tabela 2 para solução de problemas).
- Repita o passo 3.4.5 em diferentes condições (por exemplo, intensidade/duração diferente da estimulação, introdução de um bloqueador farmacológico, etc.), dependendo da questão específica que está sendo abordada.
- Interrompa a aquisição quando a célula mostrar sinais de deterioração da saúde: despolarização abaixo de -45 mV, aumento do nível basal de Ca2+, deterioração morfológica dos dendritos (por exemplo, bolhas, fragmentação; consulte a Tabela 2 para solução de problemas).
- Para obter informações preliminares sobre a morfologia da célula e manter um registro da localização da pipeta de estimulação, adquira uma pilha Z da célula no canal vermelho. Usando o software de aquisição no modo 'xyz', defina os limites superior e inferior da pilha para criar imagens de toda a célula com todos os processos incluídos. Defina o 'tamanho do passo' em 1 μm e inicie a aquisição da pilha usando o botão "Iniciar registro".
- Quando a aquisição da pilha Z estiver concluída, use a opção "Projeção máxima" no software para sobrepor todos os planos focais da pilha e verificar a qualidade da aquisição. Em seguida, retraia lentamente a pipeta de remendo para fora da fatia.
- Para fixar a fatia para identificação morfológica post hoc, remova rapidamente a fatia do banho usando um pincel plano e coloque-a entre dois papéis de filtro em uma placa de Petri cheia de ACSF. Substitua o ACSF por uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% e deixe o prato em uma sala a 4 ° C ou geladeira durante a noite.
Tabela 1: Receitas de solução. Compostos e concentrações para soluções usadas durante o protocolo.
| solução | componente | Concentração (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | algarismo |
| NaHCO3 | 26 |
| glicose | 10 |
| CaCl2 | algarismo |
| Recuperação ACSF | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| glicose | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Sacarose | Kcl | algarismo |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| glicose | 10 |
| sacarose | 219 |
| CaCl2 | 1 |
| Solução de patch baseada em K+ | K+-gluconato | 130 |
| HEPES | 10 |
| MgCl2 | algarismo |
| Fosfocreatina di(tris)sal | 10 |
| ATP-Tris | algarismo |
| GTP-Tris | 0,2 |
| Biocitina | 72 |
| Alexa-594 | 0,02 |
| Oregon Verde-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabela 2: Tabela de solução de problemas. Soluções para problemas comuns que podem surgir durante um experimento de imagem de Ca2+.
| problema | solução |
| Não é possível corrigir o neurônio saudável | Verifique se há sinais de que as fatias não são saudáveis: células encolhidas ou inchadas, núcleos visíveis, etc. Em caso afirmativo, descarte as fatias. Verifique também a resistência da pipeta e a osmolalidade da solução; substitua-os se os valores não estiverem no intervalo apropriado. |
| O sinal de fluorescência dos dendritos é baixo | Aguarde mais tempo para que a célula seja preenchida. Se uma obstrução estiver impedindo que a solução adesiva se difunda na célula, tente aplicar uma pequena quantidade de pressão negativa na pipeta adesiva. |
| A estimulação elétrica não evoca uma resposta de Ca2+ | Verifique a presença de um artefato no registro eletrofisiológico. Se ausente, verifique se há mau funcionamento da unidade de curto-circuito/estimulação. Se presente, aumente a intensidade da estimulação ou mova a pipeta de estimulação para mais perto do dendrito. Deve-se notar que a distância entre o eletrodo de estimulação e o dendrito não deve exceder 8 um para evitar a despolarização direta dos dendritos ao estudar as respostas sinápticas. |
| O sinal evocado de Ca2+ está muito alto/satura o indicador de Ca2+ | Reduza a potência do laser. Se o problema persistir em várias células, use um indicador de Ca2+ diferente com uma afinidade de Ca2+ mais baixa. |
| O sinal basal de Ca2+ está aumentando gradualmente durante o experimento | Aguarde um período mais longo entre as varreduras individuais. Se a linha de base ainda estiver aumentando, pare a aquisição; Isso indica que a saúde da célula provavelmente está diminuindo. |
| A amplitude do sinal de Ca2+ diminui durante as varreduras | Reduza a potência do laser ou diminua o zoom (se aplicável). |
| O dendrito está se fragmentando ("blebbing") após a varredura | Reduza a potência do laser ou diminua o zoom. Se o blebbing for limitado ao dendrito alvo, escolha outro dendrito e reduza a potência do laser/diminua o zoom. Se vários dendritos estiverem borbulhando, interrompa a aquisição. |
| Os sinais de fluorescência estão "saindo" da linha de varredura após as varreduras | Reduza o movimento na fatia reduzindo a velocidade de perfusão ACSF. Antes de corrigir, certifique-se de que a fatia esteja fortemente fixada no lugar por uma rede. |
