Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Montagem da pipeta de injecção de gravação
- Puxe um capilar de vidro de aproximadamente 7 cm de comprimento (1 mm de diâmetro externo) usando um extrator de pipeta.
- Quebre a ponta capilar e verifique a abertura sob um microscópio óptico. Confirme se o diâmetro interno está entre 30 μm e 40 μm.
- Insira um fio de prata de 7 cm de comprimento no capilar de vidro com aproximadamente 1 cm saliente da extremidade não cônica da pipeta de vidro.
- Dobre o excesso de filamento ortogonalmente ao capilar de vidro.
- Aplique uma gota de adesivo plástico flexível na haste de uma agulha hipodérmica de 30 G.
- Insira uma agulha hipodérmica de 30 G na pipeta de vidro de acordo com os esquemas apresentados na Figura 1.
- Adicione uma segunda camada de cola para garantir uma vedação adequada da junção entre a pipeta de vidro e a agulha hipodérmica.
- Deixe a pipeta secar com a ponta voltada para cima por cerca de 12 horas para garantir a cura adequada da cola. O resultado final é mostrado na Figura 2.
NOTA: Este procedimento é feito em experimentos agudos e a esterilização da ponta da pipeta não é necessária.
2. Preparação Animal
- Coloque o rato em uma caixa de anestesia.
- Induzir a anestesia com isoflurano a 4% por 5 a 10 min.
- Coloque o animal em uma mesa estereotáxica com uma almofada de aquecimento e sonda retal para manter uma temperatura corporal de 37 °C. Use um cone nasal com isoflurano a 2% para manter a anestesia. Prenda a cabeça do rato usando barras auriculares e um suporte de dentes.
- Aplique pomada oftálmica ou colírio, incluindo gotas de atropina a 1%, para ajudar na dilatação da pupila. Para evitar o ressecamento, aplique gotas lubrificantes aproximadamente a cada 30 minutos.
- Raspe a cabeça e limpe-a com 10% de iodopovidona.
- Para anestesia local, injete 0,5 ml de lidocaína a 2% sob o couro cabeludo em 2-3 locais, levantando a pele e inserindo a ponta da agulha.
- Confirme um nível adequado de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé e observando a falta de movimento. Além disso, a frequência cardíaca deve ser monitorada para garantir que esteja dentro dos valores normais (300 a 400 batimentos/min).
- Incise o couro cabeludo em linha reta ao longo da mediana com uma lâmina de bisturi #10 para expor as suturas coronal e sagital.
- Revele os pontos Lambda e Bregma afastando o tecido que cobre o crânio com uma espátula cirúrgica.
- Nivele o crânio para que as posições Bregma e Lambda fiquem no mesmo plano.
- Para definir o ponto de referência, use um dispositivo estereotáxico com um tubo de vidro montado para colocá-lo logo acima de Bregma. Este será o "zero" para as coordenadas de medida ântero-posterior e médio-lateral.
- Defina o ponto de interesse movendo a montagem estereotáxica para as coordenadas necessárias, observe as coordenadas estereotáxicas e desenhe um quadrado ao redor da área alvo que marca onde a craniotomia será realizada.
- Use uma broca cirúrgica com uma broca esterilizada ao longo do quadrado marcado lentamente, sem pressão, para remover o material ósseo. Tenha cuidado para não perfurar por muito tempo na mesma área, pois isso produzirá calor e causará lesões no córtex.
- Quando o osso que delimita a craniotomia se tornar suficientemente fino, remova cuidadosamente a seção craniana com uma pinça para expor o córtex.
- Freqüentemente, irrigue o córtex exposto com líquido cefalorraquidiano artificial para evitar a dessecação do tecido.
nota: A remoção da dura-máter é desnecessária no rato, pois a ponta do injetor é resistente o suficiente para penetrar.
3. Enchimento e montagem do sistema de injeção
- Encha a microsseringa de 5-10 μl por aspiração com óleo mineral.
- Encha a agulha hipodérmica com a pipeta de vidro fixa com uma solução de Chicago Sky Blue (CSB) a 0,5% e ácido γ-aminobutírico (GABA) a 300 μM ou uma solução de lidocaína a 2% com CSB 9 a 0,5%. Dilua todas as soluções com solução salina.
- No caso de uma substância abundante, encha com uma seringa comum e use as técnicas preventivas usuais para evitar a formação de bolhas de ar.
- No caso de substâncias mais caras, o óleo mineral pode ser usado para encher a injeção e o agente químico pode ser introduzido por aspiração. A diferença de densidade entre óleo mineral e água é relativamente alta, portanto, essa substância é uma boa candidata para injetar soluções aquosas.
nota: Um corante pode ser adicionado para confirmar a separação entre os dois líquidos.
- Para encher a pipeta de injeção, aspire uma seringa de 1 ml com a solução e injete-a lentamente na pipeta.
- Preste muita atenção aos vazamentos nas regiões indicadas na Figura 1, limpando essas áreas e observando os vazamentos injetando a solução lentamente com a seringa.
- Retire a seringa de 1 ml. Ao fazer isso, mantenha uma leve pressão no êmbolo para que o vácuo não remova a solução da pipeta de injeção.
- Aspire a microsseringa com óleo mineral e fixe-a firmemente à pipeta de injeção cheia. Em seguida, limpe cuidadosamente qualquer excesso de solução da injeção montada com gaze.
- Injete um volume muito pequeno, o suficiente para ver uma pequena gota se formar na ponta da pipeta de vidro, para verificar se a ponta não está bloqueada.
- Monte o injectrode no sistema de microbomba e certifique-se de que está bem fixado.
- Posicione cuidadosamente a ponta injetada nas coordenadas alvo e abaixe a ponta até a superfície do córtex.
- Abaixe lentamente o injectrode usando o aparelho estereotáxico até a estrutura-alvo (colículo superior) usando as coordenadas anatômicas apropriadas.
- Cubra o córtex exposto com ágar quente para evitar a dessecação do tecido.
4. Injeção e Inativação Reversível
- Defina a bomba de microinjeção para injetar 400 a 800 nl a 40 nl/min e pressione Executar para iniciar a injeção. Observe que a taxa de pico mostrará uma redução durante a injeção.
NOTA: Na configuração experimental, a atividade neural se recuperou dentro de uma hora após o término da entrega do GABA. Qualquer dispositivo mecânico calibrado pode ser usado para aplicar pressão na seringa de microinjeção e conduzir a injeção.
- Depois de adquirir os dados eletrofisiológicos, eutanasiar usando um método aprovado pela Comunidade de Ética Animal local.
